孔福全，馬南茹，隋 麗，＊，王 瀟，劉曉丹，張小玲，劉建成，周平坤，＊

（1.中國原子能科學研究院 核物理研究所，北京 102413；2.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850）

質子誘導AHH-1細胞PIG3基因的mRNA表達和細胞周期改變研究

孔福全1，馬南茹1，隋 麗1，＊，王 瀟1，劉曉丹2，張小玲1，劉建成1，周平坤2，＊

（1.中國原子能科學研究院 核物理研究所，北京 102413；2.軍事醫(yī)學科學院 放射與輻射醫(yī)學研究所，北京 100850）

本文利用串列加速器加速的21MeV的質子束流對人正常淋巴細胞AHH-1進行輻照，研究了質子誘導AHH-1細胞PIG3基因的mRNA表達量和細胞周期改變的劑量和時間相關性。實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）結果顯示，質子輻照后，PIG3基因mRNA的表達量隨劑量的增大而增大，表現(xiàn)出很好的劑量相關性。在不同的劑量點下，表達量隨時間的變化趨勢也大致相似，峰值出現(xiàn)的時間點除8Gy劑量點出現(xiàn)在12h外，其他劑量點均在照后6h達到。理論擬合曲線和實驗數(shù)據(jù)也呈現(xiàn)出很好的一致性。細胞周期檢測結果顯示，在每個劑量點下，G2／M期細胞隨著時間的延長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。以上結果說明PIG3基因mRNA的表達量在生物劑量計的應用上可能具有一定的基礎和潛力，值得進一步研究。

質子；PIG3基因；劑量；生物劑量計

核能的普及應用、核武器等戰(zhàn)略核力量的存在以及載人航天飛行的快速發(fā)展，使人類面臨核與空間輻射的威脅大幅增加。第一時間獲得人員的受照劑量，評估輻射對人體造成的危害是實施正確救治措施的基礎。劑量儀、探測器等物理劑量測量方法可給出精確的劑量值。但面臨突然發(fā)生、無法預料的核事故或核恐怖襲擊時，物理劑量可能不能及時得到，這時生物劑量計就展現(xiàn)出了物理劑量計所不可比擬的優(yōu)點。近年來國內外已得到應用或正在研究的生物劑量估計方法有多種，但各種方法均有其局限性［1－3］。

Polyak等［4］、龍賢輝等［5－6］研究了人淋巴母細胞AHH-1輻照后基因表達的變化，發(fā)現(xiàn)PIG3（p53誘導的基因3）基因起到了一定的作用［7］。劉曉丹等［8］進行了γ輻射誘導淋巴母細胞AHH-1中PIG3表達的劑量相關性研究，發(fā)現(xiàn)PIG3基因mRNA的表達水平與劑量和時間具有一定的效應關系。潘艷等［9］進行了γ輻射誘導人外周血淋巴細胞永生化細胞32F中PIG3基因mRNA表達的劑量相關性研究，也發(fā)現(xiàn)了表達量與劑量和時間的效應關系。另有研究［10］表明，受0.05～0.2Gy的γ射線誘導后，AHH-1細胞的PIG3基因mRNA的表達量有所升高，并且PIG3基因mRNA的表達量與輻照劑量呈一元二次關系。

本文擬采用質子束流對人類正常淋巴母細胞AHH-1進行輻照，研究質子誘導AHH-1細胞PIG3基因mRNA的表達量與輻照劑量之間的關系，以及其隨時間的變化。

1 實驗材料及方法

1.1 試劑及儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基，美國Hyclone公司；新生胎牛血清，美國Hyclone公司；TRNzol-A＋總RNA提取試劑，天根生化科技（北京）有限公司；GoldScript cDNA合成試劑盒，美國Invitrogen公司；Quantscript RT Kit Quant cDNA第1鏈合成試劑盒（KR103），天根生化科技（北京）有限公司；Real Master Mix（SYBR Green，F(xiàn)P202），天根生化科技（北京）有限公司；Chromo4實時熒光PCR儀，美國Bio-Rad公司；紫外分光光度計（由外單位檢測），德國Eppendorf公司；流式細胞儀，美國Becrman Coulter公司。

1.2細胞培養(yǎng)及照射

所用細胞為人類正常淋巴母細胞AHH-1，源自人類外周血B淋巴細胞，由軍事醫(yī)學科學院贈送。AHH-1細胞為懸浮細胞，以RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時補加10%的新生胎牛血清。培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2／95%空氣、100%相對濕度下生長。培養(yǎng)至指數(shù)生長期，以備照射。

1.3 質子輻照實驗

輻照前離心收集指數(shù)生長期的淋巴母細胞AHH-1，用少量培養(yǎng)基吹打均勻并分裝于200μL微量離心試管（EP管）中，用中國原子能科學研究院HI-13串列加速器的Q3D磁譜儀進行質子輻照，加速器產生的質子能量為22MeV，經(jīng)過100μm的膜窗、300μm的鋁箔及50cm的空氣后，質子能量下降到約21MeV。

樣品輻照時將EP管固定于樣品板并置于正對束流中心位置處，面向質子出射窗口進行照射。通過多次重復測量，得到樣品點質子注量與監(jiān)測點質子注量的比值。由式（1）計算21MeV質子在水中的輻照劑量與注量的轉換關系：

D＝1.6×10－9×LET×F／ρ（1）式中：D為劑量，Gy；LET為傳能線密度，keV／μm；F為離子注量，cm－2；ρ為粒子通過的物質的密度，g／cm3。

利用SRIM程序模擬計算得到21MeV質子在水中的LET為2.5keV／μm，由式（1）計算得到產生1Gy劑量所需的質子注量為2.5× 108cm－2，實現(xiàn)2、6、8Gy吸收劑量分別需要1×109、3×109、4×109cm－2的質子注量。

質子輻照后收集細胞，更換新的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于質子輻照后的6、12、24、48h離心收集細胞；除去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次；再用1mL PBS緩沖液重懸細胞。取0.9mL重懸細胞用于實時熒光定量PCR確定PIG3基因mRNA的表達水平，0.1mL用于流式細胞儀細胞周期的檢測。

1.4 PIG3基因mRNA的表達量檢測

1）細胞總RNA提取

在輻照后指定時間離心收集細胞，將收集的細胞用PBS洗滌2次，加入適量Trnzol，充分裂解后于－20℃臨時保存。收集完成后統(tǒng)一按試劑說明書提取總RNA，準確定量后于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）cDNA合成

所有實驗組均取2μg等量的總RNA，用Quantscript RT Kit Quant cDNA第1鏈合成試劑盒（KR103）進行cDNA反轉錄合成。反轉錄合成體系的體積為20μL，具體操作按產品說明書進行。

3）實時定量PCR

反轉錄用Bio-Rad公司的Chromo4實時熒光PCR儀，按照用戶手冊操作。PCR試劑采用Real Master Mix，采用的實時定量聚合酶鏈式反應引物是依據(jù)Cenebank數(shù)據(jù)庫中PIG3和β-肌動蛋白的基因序列所設計合成的，PIG3和β-肌動蛋白引物序列及PCR條件列于表1。每個實驗點各取1μL的第1鏈cDNA合成產物，在20μL的反應體系中進行PCR反應，每次反應均以β-肌動蛋白為對照。每個樣品同時做3個循環(huán)樣。在每次實時定量PCR反應后進行溶解曲線分析，以排除引物二聚體的影響。

表1 PCR引物序列和PCR條件Table 1 PCR primer sequence and PCR condition

4）PCR檢測數(shù)據(jù)分析

以β-肌動蛋白基因為內參基因，用比較循環(huán)閾值Ct（每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）的方法相對定量PIG3基因mRNA的表達水平，即以0Gy照射的AHH-1細胞中PIG3基因mRNA的表達量為1，其他樣品中PIG3基因mRNA的表達量均為標準樣品的n倍，依據(jù)式（2）計算PIG3基因mRNA的相對表達量RQ：

其中，ΔΔCt為目的基因的Ct與內參基因的Ct的差值。

5）細胞周期測定

于照后不同時間收集細胞，用PBS清洗2次，加預冷的75%乙醇固定24h以上；檢測前離心除去固定液，加RNA酶，于37℃水浴30min；再次離心除去RNA酶，加溴化乙錠（PI）室溫染色30min，用流式細胞儀檢測細胞周期。

2 實驗結果和討論

2.1 質子誘導AHH-1細胞PIG3基因mRNA的表達量隨劑量和時間的變化

圖1為經(jīng)質子輻照后6、12、24、48h，淋巴母細胞AHH-1的PIG3基因mRNA的表達量與質子劑量的關系及擬合曲線。由圖1可見，在質子輻照后的6、12、24、48h，AHH-1細胞PIG3基因mRNA的表達水平均隨劑量的增加而增大，0、2、6、8Gy劑量點間保持了劑量-效應的二次關系。但因8Gy劑量點PIG3基因mRNA的表達量在照后12h達到峰值，而2Gy和6Gy劑量點PIG3基因mRNA的表達量在照后12h已下降，故在12h點PIG3基因mRNA的表達量與輻照劑量關系的二次擬合表現(xiàn)相對較差。在質子輻照后的24h，各劑量點PIG3基因mRNA的表達量均處于緩慢下降過程，PIG3基因mRNA的表達量與輻照劑量呈現(xiàn)出良好的二次關系。

圖2為質子輻照后PIG3基因mRNA的表達量隨時間的變化。由圖2可見，隨劑量的變化，PIG3基因mRNA的表達量的峰值時間也不同。較低劑量點（2Gy和6Gy）在照后0～6h，PIG3基因mRNA的表達量隨時間的延長而增加，并在照后6h達到峰值，PIG3基因mRNA的相對表達量分別為10.2和19.5；照后6～12h，PIG3基因mRNA的表達量快速下降，達到6h點的一半左右；照后12～24h，PIG3基因mRNA的表達量繼續(xù)下降，但變化趨勢減緩；照后24～48h，PIG3基因mRNA的表達量繼續(xù)下降，在照后48h時，PIG3基因mRNA的相對表達量分別為3.2和4.4，仍高于對照水平。質子高劑量點（8Gy）在照后0～12h內PIG3基因mRNA的表達水平隨時間不斷增大，在照后12h達到最大值，此時PIG3基因mRNA的相對表達量為48.8；照后12～24h期間，PIG3基因mRNA的表達量迅速下降；照后24～48h期間，PIG3基因mRNA的表達量繼續(xù)下降，48h點PIG3基因mRNA的相對表達量為5.29，仍明顯高于對照水平。

圖1 質子輻照后AHH-1細胞PIG3基因mRNA表達量-劑量關系曲線Fig.1 Relationship curve of PIG3gene mRNA expression of AHH-1cell with dose after proton irradiation

圖2 質子輻照后PIG3基因mRNA的表達量隨時間的變化Fig.2 Variation of PIG3gene mRNA expression of AHH-1cell with time after proton irradiation

由圖2還可看出，PIG3基因mRNA的表達量隨劑量的增大呈現(xiàn)出明顯增大的趨勢，在不同的時間點其表達量的變化雖有所不同，但整體趨勢一致。PIG3基因mRNA的表達量隨時間的變化關系均表現(xiàn)為隨著時間的延長先增大后減小，3個劑量點的曲線形狀基本相似，表達量最大的時間點2Gy和6Gy的大致相同，8Gy的相對延后。從圖1、2的擬合曲線可看出，PIG3基因mRNA的表達量與時間和劑量具有一定的對應關系。

由圖1、2可看出，在本實驗中，質子輻照正常淋巴母細胞AHH-1后，PIG3基因mRNA的表達量隨劑量的變化趨勢在不同的輻照后時間點基本一致，而在不同的劑量下其隨時間的變化趨勢也大致相同，因此可認為質子輻照正常淋巴母細胞AHH-1后，PIG3基因mRNA的表達量與劑量和時間均有很好的效應關系，因此，PIG3基因在生物劑量計的未來應用中具有一定的潛力。

2.2 質子誘導AHH-1細胞周期分布隨劑量和時間的變化

圖3為質子輻照后6、12、24、48h時AHH-1細胞周期的分布。由圖3可見，在照后6h，所有受照劑量點G2／M期細胞比例均明顯增加，表現(xiàn)出一定的G2／M期阻滯，在6Gy劑量點處G2／M阻滯最強，G2／M期細胞比例為50.9%；此外，在高劑量點（6Gy和8Gy）G1期細胞比例顯著減小，表現(xiàn)出G1期抑制。在照后12h后，2Gy點G2／M期阻滯強度低于6h時的，8Gy點G2／M期細胞比例在所有時間點中為最大值，6Gy劑量點G2／M期阻滯與6h時的相比無顯著變化。在所有時間點中，3個劑量點中6Gy點處G2／M阻滯最強烈，G2／M期細胞比例最大時為52.2%。在照后24h，所有劑量點G1期細胞比例與6、12h相比均有所增加，除8Gy劑量點外，均大致恢復到正常水平；而G2／M期細胞比例與6、12h相比均明顯減小，此時G2／M期阻滯強度與劑量呈現(xiàn)正相關，在8Gy劑量點處達到最大值，對應G2／M期細胞比例約為21.3%。照后48h，所有劑量點G2／M期細胞比例均降至正常水平以下，而各劑量點G1期阻滯強度繼續(xù)增強，2Gy和6Gy點G1期細胞比例超過對照點，表現(xiàn)出G1期阻滯。

圖4為不同劑量質子輻照后AHH-1細胞周期分布隨時間的變化。從圖4可看出，隨著輻照劑量的不同，AHH-1細胞周期分布隨時間的變化趨勢也不同。2Gy點細胞損傷較小，對輻射的反應較快，在照后6h，G2／M期阻滯就達到峰值；在照后6～48h，G2／M期細胞比例呈不斷下降的趨勢；G1期細胞比例則隨時間先減小后增大，在照后48h表現(xiàn)出G1期阻滯。經(jīng)過8Gy的質子輻照，G2／M期細胞比例隨時間先增大后減小，在照后12h達到峰值。G1期細胞比例隨時間先減小后增大，在照后6～24h，G1期細胞比例均低于對照組。6Gy劑量點細胞周期分布變化介于2Gy和8Gy劑量點之間，G2／M期細胞比例隨時間先增大后減小，在照后48h下降至正常水平以下；照后6h和12h，G2／M期細胞比例分別為50.9%和52.2%，推測G2／M期阻滯峰值時間在6～12h之間。G1期細胞比例隨時間先減小后增大，在照后6～12h表現(xiàn)為G1期抑制；在照后24～48h，6Gy點的G1期細胞比例超過對照點，表現(xiàn)出G1期阻滯。

圖3 質子輻照后不同時間點AHH-1細胞周期分布與劑量的關系Fig.3 Changes in cell cycle at different time with doses after proton irradiation

圖4 不同劑量質子輻照后AHH-1細胞周期分布與照后時間的關系Fig.4 Changes in cell cycle at different doses with time after proton irradiation

由圖3、4可看出，經(jīng)質子輻照后，淋巴母細胞均發(fā)生了顯著的G2／M期阻滯。在同一劑量下，隨著照后時間的延長，G2／M期細胞比例先增大后減小。在同一時間點下，6h和12h時G2／M期細胞比例隨劑量的增大表現(xiàn)為先增大后減小，24h時G2／M期細胞比例隨劑量的增大持續(xù)增大，48h時G2／M期細胞比例隨著劑量的增大則是先呈現(xiàn)無規(guī)律減少直至最后消失。

3 結論

實驗結果表明，質子束流輻照后，在不同的時間點PIG3基因mRNA的表達量均與劑量呈現(xiàn)效應關系，曲線的變化大致相似，最大表達量的時間點也基本一致。擬合曲線和實驗數(shù)據(jù)的吻合程度也很高。由此可看出，PIG3基因mRNA與輻照劑量和輻照后的時間均具有很好的效應關系，因此在生物劑量計的應用上可能具有一定的基礎和潛力，有必要對其進行進一步的實驗和理論分析。

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mRNA Expression of Genes PIG3 and Cell Cycle Change of AHH-1 Cell Induced by Proton

KONG Fu-quan1，MA Nan-ru1，SUI Li1，＊，WNAG Xiao1，LIU Xiao-dan2，ZHANG Xiao-ling1，LIU Jian-cheng1，ZHOU Ping-kun2，＊
（1.China Institute of Atomic Energy，P.O.Box275-18，Beijing102413，China；2.Beijing Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Science，Beijing100850，China）

AHH-1cell was irradiated with proton（21MeV）at Q3Dmagnetic spectrometer of the tandem accelerator to study the dose-and time-effect of PIG3gene mRNA expression in AHH-1cell.Real-time quantitative PCR results show that PIG3gene mRNA expression increases with doses at the different time after proton irradiation.And the PIG3gene mRNA expression changes along with time at each dose.The peak of the PIG3gene mRNA expression appears at 6hfor every dose except the 8Gy at 12h.The results of cell cycle show that the percent of G2／M first increases and then decreases with time.These results show that PIG3gene mRNA expression in the application of biological dosimeter is potential.

proton；PIG3gene；dose；biological dosimeter

Q691.5

：A

：1000-6931（2015）05-0955-06

10.7538／yzk.2015.49.05.0955

2014-01-20；

2014-05-23

孔福全（1979—），男，河北滄州人，副研究員，博士，輻射生物專業(yè)

＊通信作者：隋 麗，E-mail：lisui＠ciae.ac.cn；周平坤，E-mail：zhoupk＠nic.bmi.ac.cn