陳愉生，涂洵崴，俞梅娥，林獻(xiàn)，李鴻茹

（福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350001）

研究報(bào)告

胸腔原位種植與經(jīng)左心室注射建立肺癌腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的比較

陳愉生*，涂洵崴，俞梅娥，林獻(xiàn)，李鴻茹

（福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福州 350001）

目的為研究肺癌腦轉(zhuǎn)移機(jī)制提供一種可靠的造模方法。方法18只BALB/c nude裸鼠隨機(jī)分為2組，分別經(jīng)胸腔原位種植與經(jīng)左心室注射的方法，接種處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人肺腺癌PC-9細(xì)胞（1×106/0.1 mL），接種后觀察裸鼠狀態(tài)，在裸鼠出現(xiàn)嚴(yán)重惡液質(zhì)時(shí)處死。解剖裸鼠，觀察肺、腦、肝、腎轉(zhuǎn)移情況；病理取材、HE染色觀察。結(jié)果胸腔原位種植組：3周后，第4、6、9號(hào)裸鼠可見(jiàn)胸壁瘤結(jié)凸起形成，漸增大；裸鼠于第4～6周開(kāi)始出現(xiàn)體重減輕，并逐漸出現(xiàn)惡液質(zhì)，分別于第5～7周處死。開(kāi)胸后見(jiàn)：胸腔廣泛灰白色腫瘤結(jié)節(jié)、團(tuán)塊形成，雙側(cè)肋骨、胸膜、脊柱多發(fā)種植灶，雙肺被侵蝕壓縮，顏色蒼白，形態(tài)改變。HE染色見(jiàn)：肺表面廣泛種植瘤形成，與正常肺組織分界清楚；僅6號(hào)裸鼠出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移。經(jīng)左心室注射組：裸鼠于第3周開(kāi)始出現(xiàn)體重下降，并逐漸出現(xiàn)惡液質(zhì)，全部裸鼠于第4周處死。開(kāi)胸后：除11、18號(hào)裸鼠胸壁見(jiàn)2～3個(gè)散在瘤結(jié)分布（直徑約1～3 mm），其余胸腔視野正常；肺組織輪廓清楚，未見(jiàn)瘤結(jié)生成。HE染色見(jiàn)：9只裸鼠均出現(xiàn)大小不一的多發(fā)腦轉(zhuǎn)移灶。胸腔原位種植組：腦轉(zhuǎn)移率為11.1%；經(jīng)左心室注射組：腦轉(zhuǎn)移率為100%。結(jié)論經(jīng)左心室注射建立肺癌腦轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的方法，較胸腔原位種植的方法保證了更高的腦轉(zhuǎn)移率。

肺癌腦轉(zhuǎn)移；左心室注射；胸腔種植；動(dòng)物模型

肺癌作為一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率占癌癥死亡率之首［1］。肺癌最常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一是腦部，肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為23%～65%，是腦轉(zhuǎn)移性腫瘤中最常見(jiàn)的類型［2］。由于腦組織解剖結(jié)構(gòu)與功能的特殊性，肺癌腦轉(zhuǎn)移患者放、化療效果不佳，預(yù)后差，其中位生存期僅有4～5個(gè)月［3］。本研究以PC-9人肺腺癌細(xì)胞分別經(jīng)胸腔原位種植與左心室注射的方法，接種裸鼠，擬建立肺癌腦轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為下一步研究腦轉(zhuǎn)移具體機(jī)制提供可靠的造模方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裸鼠與細(xì)胞

BALB/c nude裸鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK（滬）2012-002】，18只，體重（16 ±2）g，4～6周齡，均為雌性，隨機(jī)編號(hào)1ˉ18（1ˉ9為胸腔原位種植組，10ˉ18為經(jīng)左心室注射組），飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物室【SYXK（閩）2012ˉ0001】；所用的飼料、水、墊料都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格滅菌處理，并按動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的3R原則給予人道的關(guān)懷。PC-9人肺腺癌細(xì)胞系由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院同濟(jì)醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)中心惠贈(zèng)。

1.1.2 試劑與設(shè)備

RPMI1640培養(yǎng)基（HyClone，美國(guó)）、胎牛血清（杭州四季青，中國(guó)）、0.25%Trypsin-EDTA（Gibco，美國(guó)）、Pen-strep雙抗（Gibco，美國(guó)）、倒置顯微鏡（奧林巴斯，日本）、生物安全柜和CO2培養(yǎng)箱（三洋，日本），舒銳insulin syringe 29G（BD，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC-9細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1% Pen-Strep雙抗，1%谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；以0.25%胰酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞懸液置備

鏡下觀察腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化制備細(xì)胞懸液，以2000 r/ min離心5 min，棄去上清液。加入無(wú)血清的1640培養(yǎng)基，吹打、再次2000 r/min離心5min，以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞密度為1×107/mL的單細(xì)胞懸液。

1.2.3 接種動(dòng)物

胸腔原位種植組：裸鼠經(jīng)5%水合氯醛麻醉，右側(cè)臥位固定，75%乙醇常規(guī)消毒裸鼠左側(cè)胸皮膚，于腋后線第6肋間進(jìn)針（以進(jìn)針突破感后再進(jìn)針3～4 mm為準(zhǔn)）。經(jīng)左心室注射組：裸鼠經(jīng)麻醉、仰臥位固定、消毒后，于胸骨左緣第二肋間旁開(kāi)2 mm處進(jìn)針（進(jìn)針前調(diào)節(jié)好BD針頭至滯留空氣0.05 mL左右后，再吸取細(xì)胞液；進(jìn)針3～5 mm，以觀察到血液噴射涌出作為進(jìn)入左心室的標(biāo)準(zhǔn)；并在10 s內(nèi)完成注射）。兩組均注入腫瘤細(xì)胞懸液0.1 mL（即1× 106個(gè)腫瘤細(xì)胞），注射完畢后快速拔針，棉簽按壓進(jìn)針點(diǎn)。PC-9細(xì)胞經(jīng)上述方法接種裸鼠各9只。接種后的裸鼠置于SPF環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，并密切觀察。

1.2.4 觀察與標(biāo)本留取

期間定期稱重，觀察裸鼠的精神狀態(tài)、一般情況等，特別注意裸鼠是否出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)、偏癱、視物不明等，當(dāng)裸鼠體重減輕20%或者低于16 g時(shí)，密切觀察是否出現(xiàn)嗜睡、行動(dòng)遲緩等癥狀或異樣體征，并于裸鼠出現(xiàn)嚴(yán)重惡液質(zhì)（主要表現(xiàn)為弓背、消瘦、精神萎靡、呼吸短促、食欲下降等）時(shí)處死。留取腦、肺、肝腎及可疑轉(zhuǎn)移灶處組織，經(jīng)脫水固定、石蠟包埋、切片、HE染色，觀察。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠的情況

兩組裸鼠注射過(guò)程中均未發(fā)生死亡。胸腔原位種植組：裸鼠于注射后第4～6周體重開(kāi)始下降，并逐漸出現(xiàn)惡液質(zhì)，期間并未出現(xiàn)顱腦變形，共濟(jì)失調(diào)、偏癱、跛行、視物不明等情況，全部裸鼠于第5～7周處死。經(jīng)左心室注射組：裸鼠于第3周開(kāi)始出現(xiàn)體重減輕，并逐漸出現(xiàn)惡液質(zhì)，期間部分裸鼠出現(xiàn)偏癱、跛行、單側(cè)眼失明，并未出現(xiàn)顱腦變形等情況，全部裸鼠于第4周處死。

2.2 肺部成瘤、腦部轉(zhuǎn)移瘤及其他臟器轉(zhuǎn)移情況

胸腔原位種植組：3周后，第4、6、9號(hào)裸鼠胸壁可見(jiàn)瘤結(jié)凸起形成，漸增大。開(kāi)胸后見(jiàn)：多個(gè)大小不一的灰白色瘤組織占據(jù)胸腔，雙側(cè)肋骨、胸膜、脊柱多發(fā)種植灶，雙肺被侵蝕壓縮、顏色蒼白、形態(tài)改變（圖1-A-B）。腦、肝、腎肉眼取材均未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶。病理HE示：殘留少數(shù)肺組織結(jié)構(gòu)背景下，大量異常腺體形成，大小不一，多數(shù)與正常肺組織分界清楚，少數(shù)腺癌細(xì)胞侵入肺實(shí)質(zhì)（圖2-A-B）；僅6號(hào)裸鼠出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移灶，直徑約2～3 mm（圖2-D）；肝、腎組織未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。經(jīng)左心室注射組：開(kāi)胸后：除11、18號(hào)裸鼠胸壁上見(jiàn)2～3個(gè)大小約為1～3 mm的瘤結(jié)形成，其余胸腔視野未見(jiàn)異常（圖1-C）；肺組織顏色潤(rùn)紅、質(zhì)軟、充氣良好，未見(jiàn)瘤結(jié)形成（圖1-D）。腦、肝、腎肉眼取材時(shí)未見(jiàn)到轉(zhuǎn)移灶（圖1-E）。病理HE示：9只裸鼠均出現(xiàn)大小不一的多發(fā)腦轉(zhuǎn)移灶（圖2-E-F）。肺、肝、腎未見(jiàn)轉(zhuǎn)移灶形成（圖2-C）。

注：A、B.胸腔原位種植組：胸腔-肺組織形態(tài)；C、D.經(jīng)左心室注射組：胸腔-肺組織形態(tài)；E.經(jīng)左心室注射組：腦；F.胸腔原位種植組：腹腔腫塊、腹腔積液。圖1 裸鼠解剖形態(tài)Note.A-B：Thorax and lung atautopsy in the orthotopic implantation group；C-D：Thorax and lung atautopsy in the left ventricular injection group；E：Brain feature in the left ventricular injection group；F：Abdominalmasses and effusion in the orthotopic implantation group.Fig.1 Macroscopic features of the nudemice

2.3 腦轉(zhuǎn)移率的比較

胸腔原位種植組腦轉(zhuǎn)移率為11.1%；經(jīng)左心室注射組腦轉(zhuǎn)移率為100%。

3 討論

肺癌最常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一是腦部，肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為23%～65%，是腦轉(zhuǎn)移性腫瘤中最常見(jiàn)的類型［2］。一直以來(lái)，人們致力于肺癌腦轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制的研究探索，希望能進(jìn)一步改善肺癌腦轉(zhuǎn)移患者的生活質(zhì)量、生存期。因此，建立一個(gè)合適的肺癌腦轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是非常必須的。

目前建立腦轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的方法主要有以下四種：①腦內(nèi)局部原位種植［4ˉ5］。腦原位植入腫瘤細(xì)胞，造成腦轉(zhuǎn)移。②尾靜脈注射［6］。小鼠經(jīng)尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞，沿血液循環(huán)播散種植在腦中；③腫瘤“原發(fā)”部位種植［7ˉ9］。模擬肺癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等發(fā)生的腦轉(zhuǎn)移，相應(yīng)地將腫瘤細(xì)胞或者腫瘤組織塊種植在肺、乳腺、前列腺、皮下來(lái)建立“原位”模型。④左心室［10ˉ12］或頸內(nèi)動(dòng)脈注射［13ˉ15］。經(jīng)左心室或頸內(nèi)動(dòng)脈注射腫瘤細(xì)胞，沿血液循環(huán)播散種植在腦中。

注：A、B.胸腔原位種植組：肺組織瘤結(jié)；C.經(jīng)左心室注射組：正常肺組織；D.胸腔原位種植組：腦轉(zhuǎn)移灶；E-F.經(jīng)左心室注射組：腦轉(zhuǎn)移灶。圖2 裸鼠病理組織形態(tài)（HE染色×10）Note.A-B：Pulmonary pathology in the orthotopic implantation group；C：Normal lung tissue in the left ventricular injection group；D：Metastatic brain lesions in the orthotopic implantation group；E-F：Metastatic brain lesions in the left ventricular injection group.Fig.2 Pathology of the nudemice.H&E staining，×10

腦內(nèi)原位種植，建模成功率高，但一般只有單發(fā)腫瘤，且不能模擬腫瘤細(xì)胞自原位形成、移行、侵入血管，透過(guò)血腦屏障的過(guò)程，在研究腫瘤腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制上具有局限性。尾靜脈注射，腫瘤細(xì)胞經(jīng)靜脈系首先滯留于肺部，只有那些通過(guò)肺毛細(xì)血管床及從肺部轉(zhuǎn)移灶脫離的腫瘤細(xì)胞方可進(jìn)入體循環(huán)，進(jìn)而形成腦轉(zhuǎn)移可能；且該方法實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，腦轉(zhuǎn)移成瘤性不高。

腫瘤“原位”種植，就肺癌腦轉(zhuǎn)移研究上，可將肺癌細(xì)胞或組織塊經(jīng)支氣管移植、胸腔注射等方法進(jìn)行原位建模研究。該方法雖較好地模擬了腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的過(guò)程，但實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，動(dòng)物模型的生長(zhǎng)一致性差，不易形成對(duì)照；而且，支氣管移植的方法操作要求高、難度大；而胸腔種植又存在氣胸、腹腔轉(zhuǎn)移等情況。本實(shí)驗(yàn)采用胸腔原位種植的方法，在注射過(guò)程中，裸鼠雖未出現(xiàn)呼吸急促、呼吸困難等氣胸表現(xiàn)；但存在胸腔廣泛種植情況，甚至轉(zhuǎn)移至腹腔，出現(xiàn)腹部腫塊、腹腔積液表現(xiàn)（圖1-F）；另外，9只裸鼠惡液質(zhì)出現(xiàn)時(shí)間不一致，沒(méi)有形成良好對(duì)照；且病理HE示：僅有一只裸鼠出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率低。我們猜想：這可能與裸鼠在腦轉(zhuǎn)移灶形成前，就因不堪胸腔負(fù)瘤狀態(tài)出現(xiàn)惡液質(zhì)死亡有關(guān)。

左心室注射、頸內(nèi)動(dòng)脈注射的方法很好地模擬了肺癌的血道轉(zhuǎn)移過(guò)程：即通過(guò)肺毛細(xì)血管床的腫瘤細(xì)胞以及從形成的轉(zhuǎn)移灶脫離的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入左心室，隨血流流向腦部，產(chǎn)生腦轉(zhuǎn)移可能［12］。此外，該方法大大減少了肺毛細(xì)血管床對(duì)腫瘤細(xì)胞的滯留，增加了穿過(guò)腦實(shí)質(zhì)的腫瘤細(xì)胞數(shù)量，并延遲因肺癌而導(dǎo)致的死亡，進(jìn)而延長(zhǎng)了腫瘤細(xì)胞在腦內(nèi)生長(zhǎng)、增殖的時(shí)間，從而獲得更高的腦轉(zhuǎn)移形成的成功可能［16ˉ17］。與頸內(nèi)動(dòng)脈注射方法相比，左心室注射雖然存在其他臟器轉(zhuǎn)移的可能，但操作方法相對(duì)簡(jiǎn)單。按照“種子與土壤”轉(zhuǎn)移學(xué)說(shuō)的觀點(diǎn)，進(jìn)入動(dòng)脈系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞形成特定器官的轉(zhuǎn)移，是腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性與靶器官微環(huán)境相互作用的結(jié)果，而與“血流機(jī)械”理論無(wú)關(guān)［18］。因此，經(jīng)左心室注射進(jìn)入體循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，雖然開(kāi)始沒(méi)有經(jīng)歷肺毛細(xì)血管床的阻滯，但在后續(xù)過(guò)程中腫瘤細(xì)胞同樣要經(jīng)過(guò)粘附、降解、遷移等過(guò)程，才能透過(guò)血腦屏障，形成腦轉(zhuǎn)移［19］。本實(shí)驗(yàn)采用左心室注射的方法：裸鼠于第3周開(kāi)始出現(xiàn)體重下降，并逐漸出現(xiàn)惡液質(zhì)，裸鼠各階段生存狀況相一致；第4周裸鼠處死時(shí)，肉眼雖未見(jiàn)到肺、腦臟器表面異常結(jié)節(jié)形成，但病理HE示：全部裸鼠均出現(xiàn)大小不一的多發(fā)腦轉(zhuǎn)移灶，腦轉(zhuǎn)移率100%；而肺組織形態(tài)正常。我們推測(cè)，這與肺癌細(xì)胞直接經(jīng)動(dòng)脈系統(tǒng)進(jìn)入腦組織有關(guān)。另外，就開(kāi)胸后少數(shù)裸鼠胸腔內(nèi)出現(xiàn)散在微小種植灶，我們考慮：左心室注射過(guò)程中，不可避免的導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞漏出至胸腔或針道帶出的可能，期望通過(guò)加強(qiáng)左心室注射方法的練習(xí)得以改進(jìn)。

綜上所述，就胸腔原位種植與經(jīng)左心室注射建立肺癌腦轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的兩種方法，在操作簡(jiǎn)并性與可行性上相當(dāng)；但經(jīng)左心室注射的方法，裸鼠各階段生存狀況相一致，且保證了更高的腦轉(zhuǎn)移率。

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Com parison between the establishmentmethods ofmousemodels of lung cancer brain metastases by intrathoracic orthotopic im plantation and by left ventricular injection

CHEN Yu-sheng，TU Xun-wei，YU Mei-e，LIN Xian，LIHong-ru
（Fujian Provincial Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350001，China）

ObjectiveTo establish an appropriate animalmodel ofbrainmetastases from lung cancer in nudemice by thoracic orthotopic implantation in the chestor left ventricular injection，and to serve further studies on themechanisms of lung cancer brain metastasis.M ethodsPC-9 cells（1×106/0.1 mL）in logarithmic phase were respectively injected into 18 nudemice by orthotopic implantation in the chest or left ventricular injection（n=9 each group）.The statuses of nudemice were observed after implantation.Animals showing clear signs of dyscrasia were killed.At autopsy，the lung，brain，liver and kidney were removed and histological sectionswere stained with H/E to detect the presence of tumor cells.Resu ltsIn the thoracic orthotopic implantation group，three weeks after implantation，the number 4，6，9 mice showed tumor nodules in the chestwall，they began to loseweight in the fourth to sixth week differently，showing signs of dyscrasia gradually，and were sacrificed at the fifth to seventh week.The thoracotomy revealed that thewhole thorax was occupied bymany large lung cancermasses，spreading into bilateral ribs，pleura and spinal vertebra，with scarce eroded，compressed，pale and distorted lung tissues left.Histological examination with HE staining showed the presence of neoplasms in their lung tissues but only the number 6 mouse showed metastatic lesions in the brain tissue.In the left ventricular injection group，themice almost began to loseweight in the third week simultaneously and becamemoribund slowly，which were all sacrificed at the fourth week.After thoracotomy，the thoraxeswere clear except the number 11 and 18 mice which appeared 2-3 tiny tumor foci in the chestwall，with normal lung tissues.Histological examination with HE staining showed the presence of brain metastases in all the ninemice.The rate of brain metastases from lung cancer in the left ventricular injection group was 100%，compared with 11.1%in the thoracic orthotopic implantation group.ConclusionsThe establishment method ofmousemodel by left ventricular injection shows significantly higher rate of lung cancer brainmetastases than that by thoracic orthotopic implantation.

Brain metastases from lung cancer；Left ventricular injection；Intrathoracic implantation；Animal model；Mice

Q95-33

A

1005-4847（2015）05-0490-05

10.3969/j.issn.1005ˉ4847.2015.05.009

2015-03-04

國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金（WKJ-FJ-17，2013-2016）；福建省立醫(yī)院優(yōu)秀青年醫(yī)師項(xiàng)目（2014YNQN03）；福建省自然科學(xué)基金（2015J01376）。

陳愉生（1957年ˉ），女，教授，博士生導(dǎo)師。Email：slyyywb@126.com