方偉建 龔偉 朱憶凌 毛衛(wèi)波 黃淵 陳國榮

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·技術(shù)交流·

結(jié)核病診斷中抗酸染色陽性對照芯片的制作及其應(yīng)用

方偉建 龔偉 朱憶凌 毛衛(wèi)波 黃淵 陳國榮

近年來中國結(jié)核病發(fā)病率呈上升趨勢[1]。結(jié)核分枝桿菌富含脂質(zhì)和分枝菌酸，可耐受酸和乙醇脫色，通常采用萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色。在臨床和流行病學(xué)中常用檢查抗酸桿菌作為結(jié)核病診斷的依據(jù)，其中菌種鑒定為結(jié)核分枝桿菌是診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。目前，尚無其他有效方法可替代抗酸染色，由于抗酸染色的陽性菌沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)，抗酸染色結(jié)果具有主觀判讀的不穩(wěn)定性。另外，抗酸染色過程中影響因素較多，設(shè)置適當(dāng)?shù)膶φ赵诮Y(jié)核病抗酸染色實驗中是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。組織芯片具有體積小、可操作性強、成本低和可比性強等特點，筆者利用組織芯片技術(shù)原理，改進(jìn)芯片制作技術(shù)，在同一張切片上設(shè)立抗酸染色陽性對照，使得染色結(jié)果判斷更為客觀可靠，提高了抗酸桿菌的檢出率，且方法簡便可行，現(xiàn)介紹如下。

材料和方法

一、制作材料和試劑來源

從麗水市中心醫(yī)院病理科2010—2013年的檔案中篩選出經(jīng)結(jié)核分枝桿菌DNA熒光探針檢測為陽性，結(jié)核分枝桿菌豐富[結(jié)核分枝桿菌>10條/高倍視野(high power field，HPF)]且分布均勻的病理標(biāo)本1例。同時查找此例患者臨床治療結(jié)果，確認(rèn)經(jīng)抗結(jié)核治療有效，復(fù)查此例病理標(biāo)本檔案，從中選出原抗酸染色切片，獲得抗酸染色呈強陽性(完全隨機選擇5個HPF，結(jié)核分枝桿菌均>10條/HPF)的組織蠟塊。自制采樣器(內(nèi)徑1.8 mm的平頭穿刺套管一套)，載玻片(購自江蘇世泰實驗器材有限公司)，Z-N抗酸染色試劑盒(購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。本研究經(jīng)麗水市中心醫(yī)院倫理委員會審核同意實施。已征得陽性對照病理標(biāo)本患者同意。

二、陽性對照芯片的制作

復(fù)查蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)切片與抗酸染色切片，選擇最具代表性區(qū)域，畫圈標(biāo)記，再在組織蠟塊上相應(yīng)區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記。用自制采樣器，從供體蠟塊中采集組織，取出1 cm×1 cm 包埋模具(日本櫻花組織包埋機Tissue-Tek TEC 5自帶模具)，先在模具底部加入少許石蠟，放置于加熱臺上使其熔化，待其完全熔化后放入所取組織芯，然后將模具移至冷卻臺稍冷卻，使組織包埋面平整后按常規(guī)操作完成包埋。將組織芯片進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為4 μm，裱貼于載玻片的一端。于60 ℃烤箱內(nèi)烤片約12 h后取出，儲藏于干燥的切片盒內(nèi)備用。

三、抗酸染色

當(dāng)需要做抗酸染色時，從備用盒中取出1張對照芯片，將待檢患者的活檢病理組織蠟塊進(jìn)行切片后，裱于對照片旁邊，用鉛筆在載玻片上注明病理號和抗酸染色，然后同時進(jìn)行烤片，切片脫蠟至水，入石炭酸復(fù)紅染液，美藍(lán)復(fù)染，脫水，透明封固(圖1)。

圖1 采樣器、制成的蠟塊與對照芯片

四、染色結(jié)果的判斷

抗酸陽性桿菌為纖細(xì)，長約3 μm(變化幅度可以很大)、紅染、不折光、稍彎的微細(xì)桿狀物，或為稍彎的念珠樣微細(xì)桿狀物，與組織切片位于同一成像水平面上，位于巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)或位于細(xì)胞之外[4]。應(yīng)用陽性對照芯片在行抗酸染色后，如果陽性對照芯片中抗酸桿菌清楚豐富(>10條/HPF)，說明抗酸結(jié)果可信。患者標(biāo)本組織中如出現(xiàn)與陽性對照芯片中(>1條/HPF)一樣的染色結(jié)果，則可判斷該患者標(biāo)本為抗酸染色陽性，如患者標(biāo)本組織染色結(jié)果為陰性且陽性對照芯片中抗酸桿菌清楚豐富(>10條/HPF)，則可判斷該患者標(biāo)本為抗酸染色陰性。如果陽性對照芯片未查見抗酸桿菌，則說明抗酸染色失敗，結(jié)果不可靠。如果陽性對照芯片中抗酸桿菌清楚、豐富，患者標(biāo)本組織檢測結(jié)果為陰性，因為兩者的標(biāo)本組織在同一切片上，染色處理過程相同，說明染色過程質(zhì)量可信，患者標(biāo)本組織檢測結(jié)果的陰性為真陰性，可避免以往抗酸染色可能因為染色失敗而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。

結(jié) 果

在抗酸染色時需要對對照陽性芯片進(jìn)行測試，以確保對照陽性芯片無皺褶與脫片。對照陽性芯片(圖2)與待檢組織相鄰，界限清晰，易于閱片。并且不影響待檢組織染色，對照陽性芯片中抗酸桿菌染色陽性清楚，抗酸桿菌豐富。顯微鏡下觀察，對照陽性芯片排列規(guī)整，閱片者很容易相互參照查待檢組織內(nèi)的染色狀況，可以根據(jù)陽性對照片的染色狀況判定待檢組織是否進(jìn)行了正確的染色過程，并且可以參照已知的陽性對照片染色結(jié)果，給予待檢組織內(nèi)是否為抗酸桿菌較為客觀的判讀。麗水市中心醫(yī)院病理科自2014年1月至2014年12月的186例患者抗酸染色均采用此方法，發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌21例，陽性率為11.3%(21/186)。

左側(cè)為陽性對照芯片，右側(cè)為待檢組織圖2 抗酸染色結(jié)果模式圖 (Z-N抗酸染色 ×400)

討 論

我國是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，2000年第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示：我國有5.5億人感染結(jié)核分枝桿菌，活動性肺結(jié)核患者451萬例(患病率367/10萬)；菌陽肺結(jié)核患者196萬例；每年死亡患者約15萬例，是其他各種傳染病與寄生蟲病死亡總和的2倍[5]。正確及時診斷結(jié)核病可指導(dǎo)臨床后期用藥治療，而在組織中找到抗酸染色陽性菌是確診結(jié)核病的有力證據(jù)。在組織切片中抗酸染色檢出陽性菌的比率較低，對抗酸染色呈陰性的患者，其他補充檢測方法較少[6]。因此結(jié)核病診斷中抗酸染色的質(zhì)量控制顯得十分重要。

結(jié)核病診斷中進(jìn)行抗酸染色時，為了確保染色片的質(zhì)量和判讀結(jié)果的準(zhǔn)確性及可重復(fù)性，必須設(shè)立合理的對照，避免假陽性、假陰性結(jié)果，以及主觀判讀的不穩(wěn)定性。而通常的抗酸染色一般沒有設(shè)立對照實驗，實驗過程中操作步驟的時間差異、試劑是否過期、試劑的用量或其他人為因素等存在差異，均可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，使得抗酸染色結(jié)果的判讀缺乏可靠性。因此，結(jié)核病診斷中設(shè)立抗酸染色陽性對照十分必要。

筆者運用組織芯片技術(shù)在結(jié)核病診斷抗酸染色時設(shè)立陽性對照具備以下優(yōu)點：(1)待檢組織和對照芯片在同一張載玻片上，在相同條件下進(jìn)行抗酸染色，保證了實驗條件的一致性，使結(jié)果更具可比性。(2)對照芯片面積很小，供體蠟塊被破壞程度小。同時抗酸染色切片歸檔保存時不需要另外單獨保存陽性對照切片，更有利于病理檔案管理。(3)對照芯片陽性對照結(jié)果有利于對染色過程的質(zhì)量控制。(4)對照芯片排列規(guī)整，與待檢組織相鄰，界限清楚，方便診斷醫(yī)師閱片和查對。

總之，結(jié)核病診斷中抗酸染色設(shè)立陽性對照十分必要，手工自制對照陽性芯片方法簡單，花費成本低，實用性強，值得臨床推廣應(yīng)用。

[1] 吳龍章,劉燕文,鐘炳棠.分枝桿菌的實驗室檢查與質(zhì)量控制.中國防癆雜志，2014，36(4):286-289.

[2] 馬玙，朱莉貞，潘毓萱. 結(jié)核病. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：100-104．

[3] 周新華. 重視結(jié)核病的影像學(xué)分析與影像技術(shù). 中國防癆雜志，2014，36(3):145-148.

[4] 趙天如，徐東明，楊晶，等. 抗酸染色陽性菌的辨認(rèn)與假陽性異物的識別. 診斷病理學(xué)雜志，2003，10(2):121.

[5] 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組,全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室．2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告.中國防癆雜志,2012,34(8): 485-508.

[6] 胥維勇.氧化劑和表面活性劑在抗酸染色中的應(yīng)用.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2013，29(1)：103-104.

(本文編輯：郭萌)

《中國防癆雜志》協(xié)辦單位名單(名單順序按照協(xié)議簽署時間排列)

1.北京金之路醫(yī)藥科技有限公司

2.北京結(jié)核病控制研究所

3.山東省胸科醫(yī)院

4.武漢市結(jié)核病防治所

5.沈陽雙鼎制藥有限公司

6.西安市結(jié)核病胸部腫瘤醫(yī)院

7.深圳市龍華新區(qū)慢性病防治中心(精神衛(wèi)生中心)

本刊編輯部

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.05.017

323000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院暨麗水市中心醫(yī)院病理科(方偉建、龔偉、朱憶凌、毛衛(wèi)波、黃淵)；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科(陳國榮)

陳國榮，Email：chengr1978@aliyun.com

2015-01-15)