徐文鑫，梅序橋

（1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 漳州 363000 E－mail：adanlover＠163.com；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬漳州市醫(yī)院檢驗科，福建 漳州 363000）

哮喘是由嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等多種細胞及其分泌細胞因子參與的氣道炎癥疾?。?］。眾多學(xué)者研究表明在哮喘患者體內(nèi)Th17細胞比率異常升高，以Th17細胞異常表達為標志的免疫激活和炎癥反應(yīng)在哮喘的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用［2］，但Th17細胞及其分泌的炎癥因子IL－17、IL－23以及相關(guān)趨化因子CCR4、CCR6以及趨化因子受體CCL20在哮喘過程中發(fā)揮的作用尚未見報道。

本研究擬通過檢測支氣管哮喘患者外周血Th17細胞上表達的相關(guān)趨化因子CCR4、CCR6表達水平以及炎癥因子IL－17、IL－23的表達變化，進一步闡明Th17細胞及其作用因子在支氣管哮喘發(fā)病機制中發(fā)揮的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月～2014年3月我院呼吸科門診及住院部中處于急性發(fā)作的支氣管哮喘患者30例為急性發(fā)作組，處于緩解期支氣管哮喘患者30例為緩解組。入選標準：①明確診斷為支氣管哮喘，診斷及嚴重和緩解癥狀判斷標準嚴格按照我國2008年中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制定的《支氣管哮喘預(yù)防指南》進行；②所有患者除哮喘外的既往病史、體檢及常規(guī)實驗室檢查均提示患者健康無其它合并癥。排除標準：①發(fā)病前4周內(nèi)因上呼吸道感染服用抗組胺類藥物、免疫調(diào)節(jié)劑及解熱鎮(zhèn)痛藥；②妊娠期或哺乳期婦女以及依從性差、流動人口等。兩組患者的年齡、性別、基礎(chǔ)疾病構(gòu)成等方面比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。另選年齡和性別相匹配的30例健康獻血員為健康對照組。本研究方案經(jīng)過醫(yī)院倫理學(xué)委員會審查批準，所有受試對象均知情同意。

1.2 主要試劑與儀器 RPMI 1640和胎牛血清（美國Thermo公司）；人淋巴細胞分離液 （天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司）；破膜劑、CD3－FITC、CD4－PE、CD196（CCR6）－APC、CD194（CCR4）－APC鼠抗人單克隆流式抗體、離子霉素（Ion）、阻斷劑莫能菌素（Mon）、刺激劑佛波酯（PMA）購自美國eBioscience公司、用于檢測血清中總IgE、IL－17、IL－23、CCL20水平的ELISA試劑盒（美國eBioscience公司；酶標儀，美國Thermo labsystem公司；流式檢測儀BD FACSVerseTMSystem，美國BD Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 T淋巴細胞檢測 采集兩組支氣管哮喘患者及健康對照者前臂外周抗凝血3ml，外周血單核細胞（PBMC，1×106／ml）由Ficoll淋巴細胞分離液提取，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入PMA、莫能霉素及離子霉素等工作液并混勻，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h。而后按T淋巴細胞流式抗體 CD3－FITC、CD4－PE、CD196（CCR6）－APC、CD194（CCR4）－APC流式抗體檢測試劑盒說明書操作，加人各流式抗體4℃避光孵育30min，而后加入流式染色緩沖液洗滌3次，采用流式細胞儀上機檢測Th17細胞（CD4＋IL－17＋）以及CCR4、CCR6的表達情況。

1.3.2 IgE、IL－17、IL－23、CCL20檢測 取支氣管哮喘患者及健康對照者前臂外周抗凝血3ml，以3 000r／min高速離心后，取血清使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測患者及健康對照者血清中總IgE、IL－17、IL－23、CCL20的表達水平，實驗過程均按試劑說明書步驟進行，檢測結(jié)果由Thermo labsystem酶標儀進行檢測分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)用（±s）表示。數(shù)據(jù)間先進行Shapiro－Wilk test正態(tài)性檢驗和Levene test方差齊性檢驗，若兩者均符合，采用單因素方差分析（one－way ANOVA），并用LSD－t檢驗進行多樣本均數(shù)間的兩兩比較。若有一項以上不符，則采用Kruskal－Wallis H檢驗和Dunn’s多重檢驗進行統(tǒng)計分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4＋IL－17＋細胞表面趨化因子受體CCR4、CCR6的表達水平檢測 對各組外周血進行流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：急性發(fā)作組外周血CD4＋IL－17＋Th17細胞、CD4＋IL－17＋CCR4＋T細胞以及CD4＋IL－17＋CCR6＋T細胞的百分率均顯著高于緩解組（t＝8.270，P＝0.001；t＝8.140，P＝0.001；t＝6.070，P＝0.002，P均＜0.01）。而緩解組外周血CD4＋IL－17＋Th17細胞、CD4＋IL－17＋CCR4＋T細胞以及CD4＋IL－17＋CCR6＋T細胞的百分率又明顯高于健康對照組（t＝7.379，P＝0.001；t＝8.435，P＝0.001；t＝8.070，P＝0.001，P均＜0.01），見表1。

表1 各組外周血Th17細胞上CCR4、CCR6的表達變化比較 （±s，pg／ml）

表1 各組外周血Th17細胞上CCR4、CCR6的表達變化比較 （±s，pg／ml）

注：與緩解組相比，a：P＜0.001；與健康對照組相比，b：P＜0.001

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2.2 支氣管哮喘患者血清中總IgE、IL－17、IL－23、CCL20的蛋白表達水平檢測 對各組外周血進行流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：急性發(fā)作組血清中總IgE、IL－17、IL－23、CCL20的蛋白表達水平均顯著高于健康對照組（t＝6.598，P＝0.001；t＝7.226，P＝0.001；t＝6.986，P＝0.001，P均＜0.01）和緩解組（t＝6.973，P＝0.001；t＝8.042，P＝0.001；t＝7.107，P＝0.001，P均＜0.01）。而緩解組血清中總IgE、IL－17、IL－23、CCL20的蛋白表達水平又明顯高于健康對照組（t＝9.468，P＝0.001；t＝6.997，P＝0.001；t＝7.645，P＝0.001，P均＜0.01），見表2。

表2 各組外周血血清中總IgE、IL－17、IL－23、CCL20的表達變化比較 （±s，pg／ml）

表2 各組外周血血清中總IgE、IL－17、IL－23、CCL20的表達變化比較 （±s，pg／ml）

注：與緩解組相比，a：P＜0.05；與常規(guī)治療組相比，b：P＜0.05

組別 n IgE IL－17 IL－23 CCL20急性發(fā)作組 30 4.75±1.08ab 102.92±20.35ab 757.81±167.43ab 42.25±3.07ab緩解組 30 2.63±0.51b 49.33±9.67b 384.8±83.11b 15.31±2.12b健康對照組 30 0.67±0.11 20.39±4.18 158.5±40.49 7.97±1.51

3 討論

哮喘是一種炎癥性疾病，炎癥細胞和炎癥介質(zhì)參與其過程［3］。主要表現(xiàn)為IgE介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，當(dāng)機體再次接觸過敏原時，IgE交聯(lián)導(dǎo)致肥大細胞和嗜酸性粒細胞脫顆粒釋放炎性介質(zhì)引起氣道的高反應(yīng)性，導(dǎo)致支氣管哮喘的發(fā)作［4］。研究發(fā)現(xiàn)IgE的增高與哮喘升高正相關(guān)［5］。Th17細胞是CD4＋T淋巴細胞的新亞群，以分泌IL－17為特征，能廣泛調(diào)節(jié)多種細胞的功能，在機體炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮促進作用［6］，它分泌的IL－17、IL－23作用于多種細胞，誘導(dǎo)CCR4、CCR6、CCL20（CCR6的配體）等多種趨化因子產(chǎn)生，募集促炎因子到達炎癥組織，通過與相應(yīng)受體結(jié)合，引起局部炎癥反應(yīng)。

趨化因子是由不同類型的細胞分泌的低分子量（8－10KD）的細胞因子，CCR6和CCR4屬于CC類趨化因子受體家族成員中的炎癥性趨化因子［7］。炎癥性趨化因子是在前炎癥性細胞因子或病原因子的刺激下，由炎癥部位的固有細胞和滲出的細胞所產(chǎn)生的，它們的主要任務(wù)是效應(yīng)細胞（包括單核細胞、粒細胞和效應(yīng)細胞）的募集。CCR4主要表達于多種淋巴細胞，其高親和力配體為胸腺和活化調(diào)節(jié)的趨化因子（TARC／CCL17）及巨噬細胞衍生的趨化因子（CCL22／STCP－1），CCR4主要通過CCR4＋TTh17細胞發(fā)揮免疫效應(yīng)［8］。CCR6主要表達在B細胞、記憶性T細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞上，優(yōu)先表達于Th17上。已有研究發(fā)現(xiàn)CCR4、CCR6的表達與IL－17的產(chǎn)生呈現(xiàn)強相關(guān)，CCR4＋CCR6＋的記憶性CD4＋T細胞亞群分泌炎癥因子IL－17，并且該群細胞表達促進Th17細胞分化的特異性核轉(zhuǎn)錄因子RORγt［9］。有研究也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL－17的T細胞也表達CCR6和CCR4，因此CCR4、CCR6可以視為Th17細胞表面特異性標志物［10］。

本組研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，急性發(fā)作組外周血CD4＋IL－17＋Th17細胞、CD4＋IL－17＋CCR4＋T細胞以及CD4＋IL－17＋CCR6＋T細胞的百分率均顯著高于健康對照組和緩解組。而緩解組外周血CD4＋IL－17＋Th17細胞、CD4＋IL－17＋CCR4＋T細胞以及CD4＋IL－17＋CCR6＋T細胞的百分率又明顯高于健康對照組。提示外周血CD4＋IL－17＋Th17細胞、CD4＋IL－17＋CCR4＋T細胞以及CD4＋IL－17＋CCR6＋T細胞的比率可能與支氣管哮喘疾病的活動性有關(guān)。我們的實驗結(jié)果與研究報道產(chǎn)生IL－17的CD4＋T細胞幾乎都表達CCR6和CCR4相一致。

同時支氣管哮喘患者血清總IgE、IL－17、IL－23、CCL20檢測結(jié)果表明哮喘患者IgE水平升高可能是Th17細胞分泌的IL－17、IL－23以及CCR6、CCR4、CCL20等趨化因子共同作用的結(jié)果。因為近年來的研究表明，體內(nèi)有十分復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，多種細胞及其產(chǎn)生的細胞因子都參與了IgE水平調(diào)控，細胞因子微環(huán)境失衡則可能是導(dǎo)致哮喘患者體內(nèi)IgE增高的關(guān)鍵。Th17通過分泌IL－17作用于多種細胞，誘導(dǎo)相關(guān)趨化因子的產(chǎn)生，募集促炎因子到達炎癥組織，通過與相應(yīng)受體結(jié)合，引起局部炎癥反應(yīng)可能是哮喘發(fā)病的重要免疫學(xué)機制。

綜上所述，支氣管哮喘的發(fā)病機制與Th17細胞以及其分泌的細胞因子、趨化因子功能失調(diào)有密切關(guān)系?？紤]可能此次入選樣本量較小有關(guān)，故有待于增加樣本量，進一步擴大研究予以證實Th17細胞以及其分泌的細胞因子、趨化因子是改善支氣管哮喘患者預(yù)后的一個新的方向，我們推測針對趨化因子受體的靶向治療可以作為治療支氣管哮喘的一個靶點。

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