陳占紅陳雪琴邵喜英許維丹王曉稼

消乳塊膠囊對乳腺腫瘤模型大鼠血漿IGF-1水平的影響

陳占紅1陳雪琴2邵喜英1許維丹3王曉稼1

目的 觀察消乳塊膠囊對乳腺腫瘤模型大鼠血漿胰島素樣生長因子-1（IGF-1）水平的影響。方法 64只50日齡SD健康雌性未孕大鼠隨機分為模型組、治療組各25只和對照組14只。模型組和治療組大鼠均先經(jīng)2次9，10-二甲基苯蒽（DMBA，15mg溶于1.5mL芝麻油，間隔1周）灌胃造模，同時治療組大鼠以消乳塊膠囊0.4g/（kg·d）灌胃，持續(xù)給藥,在第11周和14周分批處死大鼠，取乳腺組織及腫瘤組織作常規(guī)病理檢查，酶聯(lián)免疫吸附法測定血漿IGF-1水平。結(jié)果 與病理表現(xiàn)正常大鼠相比，乳腺癌變及增生大鼠血漿IGF-1水平升高明顯［（138.65±8.54）ng/mL、（212.32± 10.38）ng/mL比（97.70±5.16）ng/mL，P＜0.01］，癌變大鼠增高更為明顯，與增生大鼠相比，差異有統(tǒng)計學意義［（212.32±10.38）ng/mL比（138.65±8.54）ng/mL，P＜0.05］。模型組、治療組11、14周時血漿IGF-1較對照組明顯增高［11周：（196.99±7.85）ng/mL、（142.33±8.62）ng/mL比（101.46±7.07）ng/mL，P＜0.01；14周：（229.40±13.37）ng/mL、（138.75±8.82）ng/mL比（90.26±2.50）ng/mL，P＜0.01］，治療組11、14周血漿IGF-1水平較模型組有明顯下降［11周：（142.23±8.62）ng/mL比（196.99±7.85）ng/mL，P＜0.01；14周：（138.75±8.82）ng/mL比（229.40±13.37）ng/mL，P＜0.01］。結(jié)論 消乳塊膠囊對DMBA誘導的大鼠乳腺惡性腫瘤具有部分預防作用，其機制可能是通過降低血漿IGF-1水平來實現(xiàn)。

大鼠；乳腺腫瘤；消乳塊膠囊；胰島素樣生長因子-1

消乳塊膠囊是鄭樹教授根據(jù)乳腺良性增生癥臨床特征和育齡婦女生理特點，以及中醫(yī)肝郁氣滯生乳癖、疏肝理氣消乳癖理論設計組成的中西藥復方制劑，在治療乳腺增生、緩解乳房疼痛等方面有較滿意的臨床療效。我們前期實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)消乳塊膠囊對DMBA誘導的大鼠乳腺惡性腫瘤有預防作用，其機制可能是通過ERβ介導的保護作用和和調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平來實現(xiàn)[1-2]。有文獻[3]報道，在乳腺癌的發(fā)病過程中，血漿胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）與雌二醇相互作用，刺激乳腺上皮細胞的增生，從而使乳腺癌的發(fā)病危險性升高。本研究觀察消乳塊膠囊對9，10—二甲基苯蒽（9，10-dimethylben（a）Anthracene，DMBA）誘發(fā)SD大鼠乳腺腫瘤的IGF-1水平的影響，為進一步認識乳腺增生病和乳腺癌的形成過程、深入研究乳腺增生病和乳腺癌發(fā)病機制、尋求有效防治藥物奠定基礎。

1 實驗材料

1.1 動 物 50日齡Sprague-Dawley系雌性未孕大鼠64只，平均體質(zhì)量約180g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK（浙2003-0003），置于室溫21°C、相對濕度30%～70%、自然光照和基礎飼料喂養(yǎng)。

1.2 試劑和儀器 9，10—二甲基苯并蒽（SIGMA公司，批號076 K9430）；消乳塊膠囊（浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院制劑室制備，規(guī)格：0.4g/粒，批號20050312）；大鼠IGF-I定量ELISA試劑盒（上海西唐生物技術有限公司，批號2007080，光學顯微鏡（日本奧林巴斯）；BIO-RAD Model 680酶標儀（美國伯樂）。

2 實驗方法

2.1 造模及給藥 64只SD大鼠常規(guī)飼養(yǎng)4天后隨機分為模型組25只，治療組25只和空白對照組14只。模型組和治療組大鼠分別給予DMBA行乳腺腫瘤造模（每次用DMBA15mg溶于1.5mL芝麻油中灌胃，間隔1周），對照組以1.5mL芝麻油灌胃模擬造模；治療組給予濃度為0.048g/mL的消乳塊膠囊溶液1.5mL灌胃，每天1次，連續(xù)給藥2周后改每周5次；模型組和對照組均僅以同等體積0.5%羧甲基纖維素鈉鹽溶液（CMC）灌胃。給藥第9周根據(jù)實際體質(zhì)量調(diào)整劑量1次。持續(xù)給藥，分別在第11周和第14周分批處死，先按體質(zhì)量給予3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，采血3mL，肝素鋰抗凝，30min內(nèi)3000r/min離心10min，提取血漿，置-30℃冰柜中保存待查。取出大鼠乳腺組織及腫瘤分別置于4%甲醛溶液中固定12h。

前期實驗期間模型組、治療組分別有3只大鼠在早期死亡且未見腫塊產(chǎn)生。死因主要為肺部感染、肝臟壞死等，可能與DMBA毒性和灌胃不當致氣道阻塞有關。模型組1只大鼠在荷瘤生長后期死亡。

2.2 病理學觀察 分別于第11周及第14周時處死大鼠，取乳腺組織及腫塊分別置于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋、切片、HE染色后，光鏡下觀察。大鼠乳腺組織學分級：首先由兩位資深的病理學專業(yè)人員在不了解動物實驗分組的情況下，按乳腺組織學分級標準判定大鼠乳腺組織學分級，具體分為三個等級，分別為正常、增生和癌變。當兩位專家有分歧時，則參考第三位病理學專家的意見。

2.3 血漿IGF-1水平測定 用ELISA法測定血漿IGF-1的含量，具體方法按試劑盒提供的說明書操作。

2.4 統(tǒng)計學方法 各組動物癌變率比較用Fisher確切概率法檢驗。血清激素水平以均數(shù)加減標準差（±s） 表示，各組之間的比較采用隨機區(qū)組設計資料的方差分析。所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS15.0軟件包處理。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠乳腺組織病理學觀察 第11周大鼠乳腺組織和腫塊鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，除空白對照組外，大多數(shù)大鼠有不同程度的增生，但僅一例發(fā)生癌變，癌變率7.14%，三組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。而到14周時實驗組所有大鼠均發(fā)生增生或癌變，其中模型組癌變率83.3%，治療組癌變率25.0%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗結(jié)束時總共留取大鼠病理標本57份，其中病理表現(xiàn)正常的大鼠20只，增生大鼠29只和癌變大鼠8只。

3.2 不同病理類型大鼠血漿IGF-1水平比較 病理表現(xiàn)為增生及癌變的大鼠血漿IGF-1水平與病理表現(xiàn)為正常的大鼠血漿IGF-1水平比較有明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），并且以癌變大鼠升高更為明顯（P＜0.01）。見表1。

表1 不同病理類型大鼠血漿IGF-I水平比較（ng/mL，±s）

表1 不同病理類型大鼠血漿IGF-I水平比較（ng/mL，±s）

注：與正常大鼠比較，*P＜0.01；與增生大鼠比較，△P＜0.05

病理類型正常增生癌變只數(shù)20 29 8 IGF-1 97.70±5.16 138.65±8.54* 212.32±10.38*△

3.3 三組大鼠血漿IGF-1水平比較 模型組和治療組11、14周時大鼠血漿IGF-1水平較對照組有明顯增高（P＜0.01），模型組升高較治療組更明顯（P＜0.01）；且模型組在14周時IGF-1水平比11周時明顯增高（P＜0.05）。另兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 三組大鼠血漿IGF-1水平比較（ng/mL，±s）

表2 三組大鼠血漿IGF-1水平比較（ng/mL，±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.01；與11周時比較，△P＜0.01

組別對照組模型組治療組只數(shù)14 25 25 11周101.46±7.07 196.99±7.85* 142.23±8.62*▲14周90.26±2.50 229.40±13.37*△138.75±8.82*▲

4 討 論

乳腺癌病因復雜，中醫(yī)認為，乳腺癌的病機是肝氣不舒，氣機運行不暢，致使經(jīng)絡、臟腑、氣血、陰陽失調(diào)，氣滯血瘀，痰凝聚瘕，蘊毒成瘤?！跋閴K膠囊”正是根據(jù)這一理論將中藥昆布和維生素等合成復方制劑，臨床應用對乳腺良性增生病的癥狀控制較滿意，特別對緩解乳房疼痛效果較明顯。在我們前期研究工作中發(fā)現(xiàn)該藥物還具有預防和抗腫瘤作用，但其作用機制尚待明確[1-2]。

本實驗結(jié)果提示在第11周時致癌率低，全組只有1例癌變；在第14周時模型組與治療組均發(fā)現(xiàn)有不同程度的增生或癌變，癌變率為83.3%。提示DMBA的致癌作用與時間相關，與早期Talang等報道的結(jié)果相似[4]。

IGF-1是生長調(diào)節(jié)素的一種，具有廣泛的生物學作用。在乳腺癌中，可促進腫瘤細胞的生長，抑制腫瘤細胞的正常凋亡，同時增強其轉(zhuǎn)移，并認為與乳腺癌內(nèi)分泌微環(huán)境變化關系密切[5-8]。Tamimi等[9]研究發(fā)現(xiàn)IGF-1受體表達與乳腺癌的風險增加有關。文獻[6，10]報道，針對IGF-1靶點治療晚期乳腺癌的體內(nèi)外試驗取得一定成功。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血漿IGF-1在正常、增生、癌變大鼠中的水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這提示IGF-1與乳腺腫瘤的形成可能有關聯(lián)，與文獻報道IGF-I促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移相一致。

本實驗結(jié)果還表明，大鼠血漿IGF-1水平在11周和14周時，模型組、治療組血漿水平較對照組比較有明顯增高，并且以模型組升高更為明顯，治療組較模型組明顯降低（P＜0.01），這提示IGF-1可能參與DMBA誘導大鼠乳腺癌的形成過程，消乳塊膠囊可以在一定程度上抑制IGF-1的表達，這可能是消乳塊膠囊抑制大鼠乳腺惡性腫瘤生成的又一途徑。模型組IGF-1水平在14周時比11周時有增高（P＜0.05），考慮與14周時癌變率高相關，治療組11周與14周IGF-1水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這與消乳塊膠囊對DMBA誘導大鼠乳腺惡性腫瘤的抑制作用相關。有研究表明，雌二醇可調(diào)節(jié)IGF-1和IGF-1R的表達，使乳腺癌細胞對IGF-1敏感性增加，反之IGF-1與IGF-1R結(jié)合通過影響細胞內(nèi)的蛋白合成翻譯過程而影響雌激素受體的表達，從而影響雌激素的作用[11-12]。對于DMBA誘導大鼠乳腺癌形成的分子特征，文獻認為多為激素依賴性[13]，我們前期實驗中也得到相同的結(jié)果[2]。而關于IGF-1與雌二醇的關系我們將在下一步的研究中繼續(xù)探索。

［1］王曉稼，鄭樹.消乳塊膠囊預防乳腺腫瘤的實驗研究［J］.實用腫瘤雜志，2002，17（2）：114-116.

［2］陳占紅，王曉稼.消乳塊膠囊抑制DMBA誘發(fā)大鼠乳腺癌及其機制［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2009，11（5）：1031-1033.

［3］Martin MB，Stoica A.Insulin-like growth factor-i and estrogen interactions in breast cancer［J］.允Nutr，2002，132（12）：3799S-3801S.

［4］Telang NT，Kurihara H，Wong GY，et al.Preneoplastic transformation in mouse mammary tissue：Identification and validation of intermediate biomarkers for chemoprevention［J］. Anticancer Res，1991，11（3）：1021-1027.

［5］允ackson允G，Zhang X，Yoneda T，et al.Regulation of breast cancer cell motility by insulin receptor substrate-2（irs-2）in metastatic variants of human breast cancer cell lines［J］. Oncogene，2001，20（50）：7318-7325.

［6］Sachdev D，Li SL，Hartell允S，et al.A chimeric humanized single-chain antibody against the type i insulin-like growth factor（igf）receptor renders breast cancer cells refractory to the mitogenic effects of igf-i［J］.Cancer Res，2003，63（3）：627-635.

［7］Shi R，Yu H，McLarty允，et al.IGF-1 and breast cancer：a meta-analysis［J］.Int允Cancer，2004，111（3）：418-423.

［8］Morgillo F，De Vita F，Antoniol G，et al.Serum insulin-like growth factor 1 correlates with the risk of nodal metastasis in endocrine-positive breast cancer［J］.Curr Oncol，2013，20（4）：e283-288.

［9］Tamimi RM，Colditz GA，Wang Y，et al.Expression of IGF-1R in normal breast tissue and subsequent risk of breast cancer［允］.Breast Cancer Res Treat，2011，128（1）：243-250.

［10］Saldana SM，Lee HH，Lowery F允，et al.Inhibition of type I insulin-like growth factor receptor signaling attenuates the development of breast cancer brain metastasis［J］.PLoS One，2013，8（9）：e73406.

［11］Oesterreich S，Zhang P，Guler RL，et al.Re-expression of estrogen receptor alpha in estrogen receptor alpha-negative mcf-7 cells restores both estrogen and insulin-like growth factor-mediated signaling and growth［J］.Cancer Res，2001，61（15）：5771-5777.

［12］Hawsawi Y，El-Gendy R，Twelves C，et al.Insulin-like growth factor-oestradiol crosstalk and mammary gland tumourigenesis［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1836（2）：345-353.

［13］Iino Y，Izuo M，Horiuchi R.Estrogen and progesterone receptor levels in 7,12-dimethylbenz[a]anthracene-induced rat mammary tumors in each week-check points about experimental studies using dmba-induced tumors［J］.允pn允Exp Med，1990，60（6）：351-354.

（收稿：2015-02-06 修回：2015-05-19）

Effect of"Xiao Rukuai"Capsule on Plasma Insulin-like Growth Factor-1 in Rats with Mammary Tumor

CHEN Zhanghong1,CHEN Xueqin2,SHAO Xiying1,XU Weidan3,WANG Xiaojia1. 1 Department of Oncology, Zhejiang Cancer Hospital,Hangzhou(310022),China;2 Biological Treatment of Cancer,Hangzhou Cancer Hospital, Hangzhou(310002),China;3 College of Medicine and Health,Lishui University,Lishui(323000),China

Objective To investigate the anticancer effect of"Xiao Rukuai"capsule on plasma insulin-like growth factor-1（IGF-1）in rats with mammary tumor.Methods Sixty-four 50-day-old female Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups∶model group（n=25）,therapy group（n=25）,and control group（n=14）.Model group and therapy group were given DMBA by intragastric administration（15mg in 1.5mL sesame oil,twice,one week interval）.Rats in therapy group were given additonal"Xiao Rukuai"capsule[0.4g/（kg·d）]by intragastric administration. All rats were killed in 11th or 14th week.The breast tissue or neoplasma were observed by routine pathology.The plasma IGF-1 levels were detected by ELISA assay.Results Compared to normal group,the levels of IGF-1 were remarkably higher in the cancerous and hyperplastic group（138.65±8.54ng/mL and 212.32±10.38ng/mL vs 97.70± 5.16ng/mL,P＜0.01）;a significant difference was found between cancerous group and hyperplasia group（212.32± 10.38ng/mL vs 138.65±8.54ng/mL,P＜0.01）.At 11th and 14th week,the levels of IGF-1 in the plasma in model and therapy group were significantly higher than that in control group（at 11th week∶196.99±7.85ng/mL and 142.33± 8.62ng/mL vs 101.46±7.07ng/mL;at 14th week∶229.40±13.37ng/mL and 138.75±8.82ng/mL vs 90.26±2.50ng/mL;all P＜0.01）.After"Xiao Rukuai"capsule treatment,the levels of IGF-1 reduced remarkably,with a significant difference compared to that in model group（at 11th week∶142.33±8.62ng/mL vs 196.99±7.85ng/mL;at 14th week∶138.75± 8.82ng/mL vs 229.40±13.37ng/mL;all P＜0.01）.Conclusion The"Xiao Rukuai"capsule has partly effect on preventing the mammary carcinogenesis induced by DMBA.The mechanism may be associated with regulating IGF-1 levels.

"rats;mammary tumor;"Xiao Rukuai"capsule;insulin-like growth factor-1

1浙江省腫瘤醫(yī)院乳腺腫瘤內(nèi)科（杭州 310022）；2杭州市腫瘤醫(yī)院腫瘤生物治療中心（杭州 310002）；3麗水學院醫(yī)學與健康學院（麗水323000）

王曉稼，E-mail：wxiaojia0803@163.com