陳琳瑤 阮 丹 王躍鑫 黃巧玲

黃芪多糖對Caco-2細(xì)胞P-gp功能、表達(dá)的影響

陳琳瑤 阮 丹 王躍鑫 黃巧玲

目的 觀察黃芪多糖（APS）對Caco-2細(xì)胞P糖蛋白（P-gp）功能、表達(dá)的影響。方法 采用MTT法考察藥物對細(xì)胞的毒性,確定藥物最大無毒濃度；流式細(xì)胞儀測定Caco-2細(xì)胞P-gp底物羅丹明-123（Rh-123）和抗體的熒光強(qiáng)度，評價APS對P-gp功能和表達(dá)的影響；建立Caco-2細(xì)胞單層模型，觀察APS對Rh-123跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。結(jié)果 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APS在0.1～100μg/mL濃度范圍內(nèi)對Caco-2細(xì)胞無明顯毒性，細(xì)胞存活率＞90%；不同濃度的APS作用后，增加細(xì)胞內(nèi)Rh-123的蓄積，對P-gp功能表現(xiàn)為抑制作用；中、高濃度50、100μg/mL的APS對P-gp表達(dá)有抑制作用［（26.72±2.43）、（23.97±2.08）比（30.10±1.28），P＜0.05］，其表達(dá)量分別降低11.23%和16.41%；高濃度APS 100μg/mL明顯抑制Rh-123的雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，對P-gp有抑制作用。結(jié)論黃芪多糖（APS）對P-gp的功能和表達(dá)有一定的抑制作用，且在高濃度尤為明顯，能顯著增加Rh-123在Caco-2細(xì)胞內(nèi)的蓄積，并抑制其雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。

黃芪多糖；P糖蛋白；Caco-2細(xì)胞

中藥輔助治療腫瘤具有毒性小、安全有效、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢，其在逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）[1-3]研究中受到越來越廣泛的關(guān)注。腫瘤多藥耐藥(MDR)是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)耐藥的同時，對其他結(jié)構(gòu)不同作用靶位不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，其中P糖蛋白（P-gp）介導(dǎo)的多藥耐藥現(xiàn)象引起了廣泛的關(guān)注[4]。P-gp是一種能量依賴性膜蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞，能將藥物逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外。在腫瘤治療中，P-gp能將化療藥物排出胞外，降低胞內(nèi)藥物濃度，從而對治療造成不利影響。我院的復(fù)方氨肽口服液中主要中藥組分為黃芪提取液，主要有效成分為黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS），臨床上廣泛用于調(diào)節(jié)免疫功能。臨床試驗(yàn)表明，復(fù)方氨肽口服液可通過體內(nèi)免疫增強(qiáng)起到輔助抗癌作用[5-6]，然而該藥是否對P-gp存在抑制作用從而逆轉(zhuǎn)MDR現(xiàn)象則尚不明了。本實(shí)驗(yàn)采用人結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞Caco-2細(xì)胞為模型，研究復(fù)方氨肽口服液主要成分黃芪多糖對Caco-2細(xì)胞P糖蛋白功能、表達(dá)的影響，為復(fù)方氨肽口服液在臨床上的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物及試劑 Caco-2細(xì)胞（上海細(xì)胞庫），0.25%胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、0.01mol/L磷酸鹽緩沖鹽（PBS）（GIBCO，USA），胎牛血清（FBS）（杭州四季青生物材料有限公司），二甲基亞砜（DMSO）（Sigma，USA），100U/mL青-鏈霉素雙抗（碧云天生物技術(shù)研究所），黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS），購自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，純度：70%，鹽酸維拉帕米（Ver）（中國食品藥品檢定研究院，批號100223-200102），環(huán)孢素A（CsA）（Sigma，USA），羅丹明-123（Rh-123）（Sigma，USA）。

1.2 儀 器 恒溫CO2孵箱（Forma SeriesⅡ Water允acketed，HEPA filter，Thermo，美國），生物潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），倒置相差顯微鏡（Nikon，TS100，日本）酶聯(lián)免疫檢測儀（Wellscan MK2，Thermo，美國），流式細(xì)胞儀（Becton-Dickinson FACScalibur，美國BD公司），12孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning Costar，美國）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將對數(shù)生長期的Caco-2和ECV304細(xì)胞接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，加入5mL含10%FBS、100U/mL青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基。在37℃、5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液。待細(xì)胞長至70%～90%時用0.25%胰酶消化并傳代。

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞以2×104個/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200μL，上述條件培養(yǎng)24h，小心吸盡每孔培養(yǎng)液。設(shè)置空白調(diào)零孔、陰性對照孔及實(shí)驗(yàn)孔，其中空白孔不接種細(xì)胞。空白調(diào)零孔和陰性對照孔每孔加入不含藥物的全培養(yǎng)基200μL，實(shí)驗(yàn)孔中加入不同濃度的APS（0.1、10、20、50、100、200μg/mL）的系列工作液200μL，平行操作4份，按上述條件培養(yǎng)72h。每孔加入MTT液（5mg/ mL）20μL，37℃孵育4h。終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加150μL DMSO，振蕩搖勻使結(jié)晶物溶解，酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，以空白對照調(diào)零后，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490nm處的光密度值（OD），與陰性對照組比較計(jì)算細(xì)胞存活率，選擇存活率＞90%的最大藥物濃度。

細(xì)胞存活率100%=（實(shí)驗(yàn)組平均OD值/陰性對照組平均OD值）×100%

2.2 黃芪多糖對Rh-123攝取的影響 精密稱取Rh-123，用去離子水溶解并稀釋，配成一定濃度的Rh-123溶液。將處于對數(shù)生長期的 Caco-2和ECV304細(xì)胞用胰酶消化，制成單個細(xì)胞，離心（1500r/min，5min），棄去上清液，PBS分散成細(xì)胞數(shù)為1×106的細(xì)胞懸液，均勻接種于EP管中。離心后棄上清液，按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入PBS配制的Ver陽性對照溶液（50μmol/L），APS系列工作液（0.1、10、20、50、100μg/mL）或PBS，于37℃、5%CO2培養(yǎng)60min，置冰上終止作用，4℃離心（2500r/min，15min），棄去上清液，冰冷的PBS洗2次。按實(shí)驗(yàn)分組分別加入Rh-123溶液或PBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)60min，置冰上終止作用，4℃離心棄去上清液，冰冷的PBS洗2次，4℃離心棄去上清液，細(xì)胞重懸于0.5mL PBS液中，用流式細(xì)胞儀測定10 000個細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。2.3 黃芪多糖對P-gp表達(dá)的影響 用0.25%胰酶將處于對數(shù)生長期的Caco-2細(xì)胞消化分散成單細(xì)胞懸液，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，加入含10%FBS、100U/mL青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基。在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入黃芪多糖系列工作液（實(shí)驗(yàn)組，20、50、100μg/mL），環(huán)孢素溶液（陽性對照組，5μmol/L）或含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基（陰性對照組）共培養(yǎng)72h。胰酶消化每瓶分裝至3個2mL的EP管，PBS洗2次，離心，棄上清液。按照實(shí)驗(yàn)分組，加入PBS或抗體，4℃，孵育12h。孵育完畢后用PBS洗2次，離心，棄上清液，最后用0.5mLPBS重懸。激發(fā)波長為466nm，發(fā)射波長為535nm，測定10000個細(xì)胞，收集535nm處的熒光進(jìn)行分析。

2.4 黃芪多糖對Rh-123跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 將密度為1×105個/mL的Caco-2單細(xì)胞懸液接種至12孔Transwell板，第一周隔日換液，后2周每日換液，待跨膜電阻值穩(wěn)定在350Ω/cm2時用于轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組見表1。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） ，組間比較用方差分析或t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 黃芪多糖對Rh-123跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)影響實(shí)驗(yàn)分組

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，APS在0.1～100μg/mL濃度范圍內(nèi)對Caco-2細(xì)胞無明顯毒性，培養(yǎng)72h后細(xì)胞存活率＞90%，見表2。故選取此濃度范圍進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究。選取維拉帕米濃度50μmol/L為實(shí)驗(yàn)濃度。由Caco-2細(xì)胞確定的非細(xì)胞毒性藥物濃度在陰性對照ECV304細(xì)胞上也沒有產(chǎn)生細(xì)胞毒性。

表2 不同藥物濃度下Caco-2細(xì)胞和ECV304細(xì)胞存活率（±s）

表2 不同藥物濃度下Caco-2細(xì)胞和ECV304細(xì)胞存活率（±s）

注：Ver：鹽酸維拉帕米；CsA：環(huán)孢素A；APS：黃芪多糖

孔數(shù) 細(xì)胞存活率（%）藥物APS（μg/mL）Ver（μmol/L）CsA（μmol/L）555555555濃度0.1 1 10 20 50 100 200 50 5 Caco-2 97.21±4.27 95.42±1.89 94.15±2.61 93.93±3.08 93.87±5.19 93.42±3.14 80.10±3.16 92.67±3.23 94.59±2.37 ECV304 97.52±3.12 95.17±4.89 96.23±2.83 95.31±3.01 94.78±2.90 91.97±3.43 83.76±2.77 95.99±2.95 94.26±2.41

3.2 黃芪多糖對Rh-123攝取的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物作用于Caco-2細(xì)胞后，APS各濃度組及陽性對照Ver組的熒光強(qiáng)度較空白對照組均有所增強(qiáng)，見表3。陽性對照組細(xì)胞內(nèi)Rh-123的熒光強(qiáng)度顯著高于空白對照組（P＜0.05），增加了42.19%，與文獻(xiàn)報道相符，說明維拉帕米對Rh-123的外排有明顯抑制作用；不同濃度的APS對Rh-123外排的抑制率隨濃度的增加而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性，該結(jié)果表明APS對P-gp的功能有一定的抑制作用。

表3 黃芪多糖對Caco-2細(xì)胞中Rh-123外排的影響（±s）

表3 黃芪多糖對Caco-2細(xì)胞中Rh-123外排的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；Ver：鹽酸維拉帕米；APS：黃芪多糖

組別空白對照組APS（μg/mL）孔數(shù)Ver（μmol/L）44444444濃度PBS 0.1 1 10 20 50 100 50細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度118.33±5.45 120.14±3.16 121.36±2.19 127.33±2.01* 138.66±4.15* 145.75±3.75* 159.00±6.40* 168.25±2.33*熒光強(qiáng)度增加百分?jǐn)?shù)（%）0 1.53 2.56 7.33* 17.18* 23.17* 34.37* 42.19*

3.3 黃芪多糖對P-gp表達(dá)的影響 研究結(jié)果表明，與Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，陽性對照組（CsA組）細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著高于陰性對照組，說明環(huán)孢素可以明顯誘導(dǎo)上調(diào)Caco-2細(xì)胞P-gp表達(dá)水平，與文獻(xiàn)報道相符。HPS低濃度組（20μg/mL）細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度與陰性對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），然而，中、高濃度組（50、100μg/mL）細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯低于陰性對照組（P＜0.05），其表達(dá)量分別降低11.23%和16.41%。以上結(jié)果表明低濃度的APS對P-gp表達(dá)基本沒有影響，隨著濃度的增加，對P-gp的表達(dá)有抑制作用，使其表達(dá)量減少，見表4。

表4 不同濃度黃芪多糖對Caco-2細(xì)胞P-gp表達(dá)的影響（±s）

表4 不同濃度黃芪多糖對Caco-2細(xì)胞P-gp表達(dá)的影響（±s）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05；CsA：環(huán)孢素A；APS：黃芪多糖

組別陰性對照組APS（μg/mL）孔數(shù)P-gp表達(dá)增加量（%）--CsA（μmol/L）44444濃度-20 50 100 5細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度30.10±1.28 29.25±3.01 26.72±2.43* 23.97±2.08* 79.85±5.15* -11.23* -16.41* 165.28*

3.4 黃芪多糖對Rh-123轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 在藥物干預(yù)3h后，Rh-123外排率有顯著變化。陽性對照維拉帕米組外排率為2.2%，較陰性對照組降低43.6%，表明其顯著抑制了Rh-123的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。APS高濃度組（100μg/mL）對Rh-123的外排率也有一定的抑制作用（P＜0.05），外排率為3.3%，較陰性對照組降低了15.4%；中、低濃度（20、50μg/mL）的APS則對Rh-123的外排轉(zhuǎn)運(yùn)抑制作用不明顯（P＞0.05），見表5。

表5 黃芪多糖干預(yù)180min后Rh-123雙向表觀通透系數(shù)Papp和外排率

4 討論

黃芪屬補(bǔ)益類中藥，可提高機(jī)體免疫力，其主要生物活性成分黃芪多糖（APS）藥理作用廣泛，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、強(qiáng)心、抗病毒、抗腫瘤等作用。APS輔助抗癌作用已有較多報道[7-8]，認(rèn)為APS通過免疫調(diào)節(jié)來發(fā)揮抗癌作用，而至于是否涉及對多藥耐藥（MDR）存在逆轉(zhuǎn)作用，則尚未完全明了。本研究發(fā)現(xiàn)，10～100μg/mL濃度范圍的APS能夠在1h內(nèi)增加Caco-2細(xì)胞內(nèi)的Rh-123的含量，抑制P-gp的功能，且呈現(xiàn)濃度依賴性。中、高濃度APS（50、100μg/ mL）不僅能抑制Rh-123的雙向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，長期使用還可抑制P-gp的表達(dá)。

上述結(jié)果表明，APS對Caco-2細(xì)胞P-gp功能和表達(dá)有抑制作用，屬于P-gp抑制劑，但抑制作用弱于維拉帕米。推測APS在與抗腫瘤藥物合用時，可抑制P-gp，增加細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，提高療效。我院自制制劑復(fù)方氨肽口服液的主要中藥組分為黃芪提取液，其有效成分為黃芪多糖。本次研究及有關(guān)臨床研究[5]顯示，復(fù)方氨肽口服液可以在腫瘤患者的臨床治療中做進(jìn)一步的推廣使用。

腫瘤多藥耐藥是造成腫瘤藥物治療失敗的重要原因之一，造成多藥耐藥的機(jī)制十分復(fù)雜，而其中對P-gp所介導(dǎo)的多藥耐藥研究也有著廣泛的研究。有研究表明，中藥輔助治療可通過競爭P-gp的結(jié)合位點(diǎn)、通過影響細(xì)胞膜的功能及通過影響ATP等方式，從而達(dá)到抑制P-gp的功能[9-12]。至于APS是通過哪種方式抑制P-gp的功能，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿：2015-03-20 修回：2015-05-11）

Effect of Astragalus Polysaccharide on the Function and Expression of P-glycoprotein in Caco-2 cells

CHEN Linyao,RUAN Dan,WANG Yuexin,HUANG Qiaoling. Pharmacy,Third People's Hospital of Hangzhou, Hangzhou(310009),China

Objective To investigate the effect of astragalus polysaccharide（APS）on the function and expression of p-glycoprotein（P-gp）in Caco-2 cells.Methods The cytotoxicity of different drug concentrations was measured by MTT assay,in order to confirm the maximum non-toxic concentration of the drug.Flow cytometry was used to detect the fluorescence of rhodamine 123 concentration and antibody concentration to evaluate the effect of APS on the function and expression of P-gp.The Caco-2 cell monolayer was built to evaluate the effect of APS on the bi-directional transports of Rh-123.Results The cell viability of Caco-2 cells was higher than 90%when the concentration of APS was between 0.1 and 100μg/mL with MTT.Compared with control groups,APS increased the cellular Rh-123 concentration,showing an inhibitory effect on P-gp function.When the cells treated with APS at 50 and 100μg/mL concentrations,respectively,the expression levels of P-gp in Caco-2 cells were decreased by 11.23%and 16.41%to 26.72±2.43 and 23.97±2.08 compared to that in control group（30.10±1.28,P＜0.05）.Rh-123 bi-directional transport experiment showed that the p-gp level was obviously inhibited after 72 h incubation with 100 μg/mL concentration APS.Conclusion APS can inhibit the function and expression of P-gp in Caco-2 cells,and can also reduce the bi-directional transport of Rh-123 when it is at a high concentration.

astragalus polysaccharide;p-glycoprotein;Caco-2 cells

浙江省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會科研項(xiàng)目（No.2013LYZD016）

杭州市第三人民醫(yī)院藥劑科（杭州 310009）

黃巧玲，Tel：（0571）86737209；E-mail：HQL6512@163.com