韋麗玲 朱美飛 黃立權(quán) 江榮林 王靈聰

·論 著·

姜黃素對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響

韋麗玲 朱美飛 黃立權(quán) 江榮林 王靈聰

目的 觀察姜黃素（Cur）對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞（HBECs）MMP-9表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)人支氣管上皮細(xì)胞，分為空白組、LPS組及LPS+姜黃素（Cur）組，其中LPS濃度為10μg/mL，姜黃素組在相同濃度LPS刺激下又各分為5、10、20、40和80μmol/L五個(gè)濃度組，作用4h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR觀察人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)量。結(jié)果 顯微鏡下觀察姜黃素（Cur）干預(yù)后HBECs細(xì)胞形態(tài)良好，無(wú)明顯損傷。RT-PCR結(jié)果顯示，空白組可見(jiàn)一定量MMP-9 mRNA表達(dá)（1.00124±0.12918）；與空白組比較，LPS組人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)量明顯增加［（1.75204±0.18837）比（1.00124±0.12918），P＜0.05］，80μmol/L Cur組亦可增加MMP-9 mRNA表達(dá)［（1.99646±0.39105）比（1.00124±0.12918），P＜0.05］。與LPS組比較，10μmol/L Cur組人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)量顯著下降［（0.67958±0.17142）比（1.75204±0.18837），P＜0.05］，5、20、40μmol/L Cur對(duì)支氣管上皮細(xì)胞MMP-9mRNA表達(dá)無(wú)明顯作用（P＞0.05）。結(jié)論 10μmol/L姜黃素（Cur）可降低人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9mRNA表達(dá)。

人支氣管上皮細(xì)胞；姜黃素；MMP-9

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一類鋅離子活性依賴、結(jié)構(gòu)高度同源、主要作用于細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白水解酶大家族，MMP-9為成員之一，屬其亞型的明膠酶一族，又稱明膠酶B。它不僅可以降解變性膠原，還可降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成分，包括IV型膠原、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白等。MMP-9可在多種細(xì)胞中表達(dá)，除了常見(jiàn)的炎癥細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞外，一些結(jié)構(gòu)細(xì)胞在刺激下也可產(chǎn)生，如支氣管上皮細(xì)胞（human bronchialepithelial cells，HBECs）、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等。近年研究顯示，多種細(xì)胞因子可刺激支氣管上皮細(xì)胞分泌MMP-9并參與氣道重建[1-2]，而脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）作為致病菌的有效成分可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，促使MMP-9的表達(dá)。研究[3-4]表明，姜黃素（curcumin，Cur）可抑制炎癥因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)擬體外培養(yǎng)觀察LPS作用下Cur對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞（human bron-chial epithelial，HBECs）MMP-9表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì) 胞 人支氣管上皮細(xì)胞株BESA-2B，由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫(kù)提供。

1.2 藥品及試劑 姜黃素（SIGMA，批號(hào) BCBL 0424V）；LPS（SIGMA，批號(hào) 122M40010）；動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒（上海捷瑞生物工程有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA synthesis Kit（Thermo Scientific Fisher公司）；qPCR試劑盒SuperRealPreMix Plus（SYBR Green)（TIANGEN公司）。

1.3 儀 器 二氧化碳培養(yǎng)箱、3111型和微量加樣器（均為Thermo公司）；倒置熒光顯微鏡（江南公司）；臺(tái)式低速離心機(jī)（80-2型，上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板（均為Corning公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化）；OD值測(cè)量?jī)x器（Merinton SMA4000）；定量PCR儀（M允Mini Personal Thermal Cycler，配套使用的分析軟件為BIORAD CFX Manager）；相關(guān)耗材如Tip頭、EP管等（Thermal Scientific Fisher公司，均為無(wú) RNase、DNase和無(wú)熱源的分子生物學(xué)耗材）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 復(fù)蘇BEAS-2B細(xì)胞，用LHC-8無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，0.125%Trypsin+ 0.01%EDTA消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)并調(diào)整細(xì)胞狀態(tài)。待細(xì)胞傳代一定程度，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，0.125%Trypsin+0.01%EDTA消化離心，計(jì)數(shù)后，以2× 105/well鋪6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)。24h后，將細(xì)胞分為空白組、LPS（10μg/mL）組、同濃度LPS+Cur各組（5μmol/L Cur組，10μmol/L Cur組，20μmol/L Cur組，40μmol/L Cur組和80μmol/L Cur組），作用4h。取Cur干預(yù)4h后的細(xì)胞放在倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。

2.2 RT-PCR法檢測(cè)MMP-9mRNA表達(dá) 細(xì)胞處理完畢，用Trizol法按照動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其加入到PCR體系中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×SuperRe alPreMix Plus，10μL；Forward primer，5μM：0.6μL；Reverse primer，5μM：0.6μL；cDNA模板（加dd H2O稀釋成7ng/μL∶8.8μL；總計(jì)20μL。MMP-9引物上游：5'-TTTGAGTCCGGTGGACGATG-3'，下游引物：5'-GCTCCTCAAAGACCGAGTCC-3'，產(chǎn)物大小為197bp。β-actin引物上游：5'-GACTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3'，下游引物：5'-GACTGCTGTCACCTTCACCGT-3'，產(chǎn)物大小為163bp。擴(kuò)增條件：95.0°C，3min；95.0°C，10s；59.0°C，20s；72.0°C，30s。共51個(gè)循環(huán)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)變化 人支氣管上皮細(xì)胞經(jīng)Cur干預(yù)后，在顯微鏡下可觀察到多數(shù)細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞無(wú)明顯損傷，見(jiàn)圖1（封二）。

3.2 各組人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9mRNA表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，空白組可見(jiàn)一定量MMP-9mRNA表達(dá)，與空白組比較，LPS組MMP-9 mRNA表達(dá)量明顯增加（P＜0.05），80μmol/L Cur組亦可增加MMP-9 mRNA表達(dá)（P＜0.05）。與LPS組比較，10μmol/L Cur組MMP-9mRNA表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），5、20、40μmol/L的Cur對(duì)支氣管上皮細(xì)胞MMP-9mRNA表達(dá)無(wú)明顯作用（P＞0.05），見(jiàn)表1?；驍U(kuò)增曲線見(jiàn)圖2（封二）。

表1 各組人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9mRNA表達(dá)量比較（±s）

表1 各組人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9mRNA表達(dá)量比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，△P＜0.05；LPS：脂多糖；Cur：姜黃素

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4 討 論

近年國(guó)內(nèi)外的研究顯示，支氣管上皮細(xì)胞在多種體內(nèi)、外因素的作用下大量表達(dá)MMP-9。Hozumi等[1]發(fā)現(xiàn)TNF-α可誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞分泌MMP-9，其信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程由NF-κB途徑介導(dǎo)；另一項(xiàng)研究亦發(fā)現(xiàn)TNF-α、刀豆素A及機(jī)械刺激人支氣管上皮細(xì)胞可導(dǎo)致MMP-9表達(dá)和分泌[5]。LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的一種成分，可介導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)分泌MMP-9。研究[6]表明，LPS是MMP-9強(qiáng)誘導(dǎo)劑，在mRNA及蛋白水平上誘導(dǎo)其高表達(dá)，且誘導(dǎo)作用與LPS的濃度和時(shí)間呈依賴性，Ma等[7]通過(guò)實(shí)時(shí)PCR及Westblot結(jié)果顯示，在肺損傷模型6h后的肺組織中，LPS組MMP-9mRNA和蛋白表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加，明膠酶譜檢測(cè)MMP-9活性亦明顯提高。Cheng等[8]發(fā)現(xiàn)在H9c2心肌母細(xì)胞株中LPS通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路能上調(diào)uPA、MMP-2、MMP-9的表達(dá)。LPS作為致病菌的主要致病成分，能激活多種細(xì)胞分泌諸如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等細(xì)胞因子，進(jìn)而激活NF-κB等信號(hào)通路途徑引起MMP-9分泌釋放。目前已經(jīng)證實(shí)，MMP-9基因啟動(dòng)子上存在NF-κB、AP-1等核因子的結(jié)合位點(diǎn)，TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子可通過(guò)這些核因子的激活而調(diào)節(jié)MMP-9的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中空白對(duì)照組支氣管上皮細(xì)胞有少量MMP-9 mRNA表達(dá)，經(jīng)LPS刺激后，與空白組比較，MMP-9 mRNA表達(dá)量明顯上升（P＜0.05），說(shuō)明人支氣管上皮細(xì)胞在經(jīng)LPS刺激后，激活一系列細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子經(jīng)過(guò)核因子-κB途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞大量產(chǎn)生MMP-9。

姜黃素（curcumine）為姜黃的天然色素，目前已作為一種有多種功效的藥物而廣泛應(yīng)用于臨床。中醫(yī)認(rèn)為，姜黃具有行氣、活血散風(fēng)和通絡(luò)止痛功效。近年研究證實(shí)姜黃素能抗氧化、抗感染、抗凝、降血脂、防動(dòng)脈粥樣硬化和抑制腫瘤生長(zhǎng)。張?bào)薜萚9]發(fā)現(xiàn)姜黃素能明顯降低TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MMP-9的表達(dá)，與Yu等[10]觀察姜黃素通過(guò)下調(diào)NF-κB抑制MMP-9表達(dá)阻礙TNF-α誘導(dǎo)人動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞移行的報(bào)道一致。而ERK1/2通路在信號(hào)傳遞中亦發(fā)揮作用，研究[8]發(fā)現(xiàn)，使用ERK1/2抑制劑后能減少M(fèi)MP-9表達(dá)，并降低后者活性。我們前期研究[11]也發(fā)現(xiàn)姜黃素能降低APE大鼠肺ERK、PI3K、Akt水平，抑制其通道，從而減少TNF-α、IL-1β、IL-6等細(xì)胞因子的釋放，減輕肺組織損傷。本研究結(jié)果顯示，擴(kuò)增曲線提示擴(kuò)增多在20～40之間，符合要求；與LPS組比較，Cur各濃度組對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)的抑制強(qiáng)度并不呈濃度依賴性，5、20、40μmol/L Cur組對(duì)LPS誘導(dǎo)下的支氣管上皮細(xì)胞作用不佳（P＞0.05），而10μmol/L Cur組作用最顯著，能明顯抑制支氣管上皮細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)（P＜0.05）。據(jù)此推測(cè)，10μmol/L Cur通過(guò)下調(diào)TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)激活而抑制ERK1/2和核因子-κB的信號(hào)通路，減少支氣管上皮細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)，在顯微鏡下也能觀測(cè)到Cur干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)良好，未見(jiàn)明顯損傷。而80μmol/L Cur組與空白組比較，Cur未見(jiàn)抑制作用，反而增加了MMP-9 mRNA表達(dá)量，提示大劑量Cur不僅不會(huì)提高療效，可能還會(huì)存在潛在的細(xì)胞毒風(fēng)險(xiǎn)，而產(chǎn)生相反的效果。

綜上所述，Cur對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)有抑制作用，以濃度10μmol/L的Cur效果最佳，其作用機(jī)制可能與細(xì)胞因子釋放激活相應(yīng)信號(hào)通路有關(guān)，有待進(jìn)一步研究闡釋其過(guò)程。

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（收稿：2014-11-24 修回：2015-05-07）

Effects of Curcumin on the Expression of MMP-9 in Human Bronchial Epithelial Cells

WEI Liling,ZHU Meifei,HUANG Liquan,允IANG Ronglin,WANG Lingcong. ICU,First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effect of curcumin（cur）on the expression of matrix metalloproteinase 9（MMP-9）in human bronchial epithelial cells（HBECs）.Methods HBECs was cultured in vitro and divided into blank group,LPS group and cur groups.LPS group was set at 10μg/mL and cur groups were set at 5 concentrations of 5,10,20,40,80μmol/L after the stimulation of the same LPS concentration.Morphological changes of HBECs were observed through a microscope after cur intervention and real-time quantitative PCR was performed to examine the dynamic expression of MMP-9 in HBECs after 4h.Results The morphology of cells were well maintained in absence of significant damage after cur intervention.Real-time PCR results showed that blank group produced a certain amount of MMP-9 mRNA expression（1.00124±0.12918）and that LPS group and cur group with 80μmol/L concentration had significantly increased expression of MMP-9 mRNA in HBECs（1.75204±0.18837 and 1.99646±0.39105 vs blank group,P＜0.05）.Compared with LPS group,cur group with 10μmol/L concentration had decreased MMP-9 mRNA exepression in cells（0.67958±0.17142,P＜0.05）,but other cur groups（5,20,and 40μmol/ L）had no marked effect on the expression of MMP-9 in HBECs（P＞0.05）.Conclusion Curcumin of 10μmol/L can lower the expression of MMP-9 mRNA in HBECs.

human bronchial epithelial cells;curcumin;MMP-9

浙江省衛(wèi)生高層次創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目資助，浙江省自然科學(xué)基金（No.Y207052，LY12H29005）

浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院ICU（杭州 310006）

王靈聰，E-mail：wlc501@139.com；Tel：（0571）86620356