錢(qián)綠麗丁彩飛

安宮方治療封閉抗體低下型復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)臨床觀察

錢(qián)綠麗1丁彩飛2

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)；封閉抗體；配偶淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療；安宮方

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續(xù)發(fā)生2次或2次以上妊娠不足28周、胎兒體質(zhì)量不足1000g的自然流產(chǎn)，過(guò)去定義為妊娠28周前連續(xù)發(fā)生3次或3次以上的自然流產(chǎn)，稱(chēng)習(xí)慣性流產(chǎn)[1]。RSA發(fā)生率約占育齡期婦女1%[2]。RSA發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，近1/2的RSA患者的病因未明[3]，稱(chēng)為原因不明性復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，且認(rèn)為大多跟免疫因素有關(guān)[4]。正常妊娠時(shí)母體通過(guò)復(fù)雜精細(xì)的免疫系統(tǒng)調(diào)控,使母體處于免疫耐受狀態(tài),保護(hù)胚胎不受母體免疫系統(tǒng)排斥而流產(chǎn)[5]。封閉抗體（blocking antibodies，BA）低下使母體免疫系統(tǒng)識(shí)別能力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致RSA[6]。配偶淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療是目前廣泛應(yīng)用于BA低下的一種方法[7]，但卻存在血源性疾病感染的可能和療效的不確定[8]。本研究觀察安宮方治療BA低下型RSA療效，報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2013年1月—2014年3月浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科門(mén)診及住院RSA患者共44例，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為安宮方組22例，年齡25～35歲，平均（29.68±3.64）歲；自然流產(chǎn)數(shù)2次17例，3次4例，3次以上1次。免疫組22例，年齡25～35歲，平均（29.91±3.45）歲；自然流產(chǎn)數(shù)2次18例，3次4例，3次以上無(wú)。兩組年齡、流產(chǎn)數(shù)具有可比性（P＞0.05）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中華婦產(chǎn)科學(xué)》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]，與同一性伴侶連續(xù)遭受2次或2次以上的妊娠28周前胎兒丟失者；流式細(xì)胞儀檢測(cè)封閉抗體水平（抗CD3－BE、抗CD4－BE、抗CD8－BE）至少1項(xiàng)低下者；中醫(yī)證型標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》、《中醫(yī)婦科學(xué)》[10]及《中醫(yī)病癥診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》擬定“脾腎虧虛兼血瘀”證型標(biāo)準(zhǔn)。主要證候：頭暈耳鳴，腰酸膝軟，氣短懶言，納少便溏，夜尿頻多，眼眶黯黑或面有暗斑，刺痛、痛有定處、拒按，脈絡(luò)瘀血（諸如口唇、齒齦、爪甲紫暗），皮下瘀斑，癥積，離經(jīng)之血，舌質(zhì)紫暗或有瘀斑瘀點(diǎn)，脈沉細(xì)或澀。以上證候中“腰酸膝軟、氣短懶言、舌質(zhì)紫暗”必備，兼具其余證候中的2項(xiàng)，即可診斷。

1.3 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡25～35歲的育齡婦女，簽署知情同意書(shū)并能按計(jì)劃堅(jiān)持治療者。排除標(biāo)準(zhǔn):男方精液常規(guī)分析不在正常范圍、性生活不正常、有內(nèi)分泌及其他免疫性疾病史；女方有內(nèi)分泌失調(diào)、甲狀腺功能異常及女性生殖道畸形;雙方有弓形體、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、風(fēng)疹病毒感染；雙方染色體核型分析異常；女方抗心磷脂抗體、抗精子抗體或抗子宮內(nèi)膜抗體等陽(yáng)性；夫妻雙方肝腎功能、心電圖、血尿常規(guī)等見(jiàn)明顯異常；過(guò)敏體質(zhì)或?qū)Χ喾N藥物過(guò)敏者；未按規(guī)定治療用藥，無(wú)法判斷療效或資料不全等影響療效或安全性判斷者。

2 治療方法

安宮方組給予安宮方（太子參、黃芪、茯苓各15g，當(dāng)歸10g，白術(shù)12g，川斷、槲寄生各15g，紅花10g，菟絲子12g，丹參15g，山萸肉9g，炙甘草5g），水煎服（由本院煎藥室代煎），每天1劑，分早晚2次口服，連續(xù)治療3個(gè)月為1個(gè)療程，3個(gè)月后復(fù)查封閉抗體。治療期間避孕，月經(jīng)期停服，經(jīng)凈后繼服。免疫組采用配偶淋巴細(xì)胞主動(dòng)免疫治療法[11]。操作步驟如下：①排除配偶患有傳染性疾病后，抽取肝素抗凝靜脈血25mL，生理鹽水稀釋至60mL后將血液沿管壁緩慢疊加于淋巴細(xì)胞分離液面上，注意保持界面的清楚，2000r/min，離心15min，分離淋巴細(xì)胞；②吸取位于上、中層界面的白色云霧層狹窄帶中的淋巴細(xì)胞，2000r/min，離心10min；③去上清液，加入0.1mL無(wú)菌注射水，一次性吸管混勻，加入RPMI 1600培養(yǎng)液至10mL，2000r/min，離心10min，再次棄去上清液，加RPMI 1640培養(yǎng)液至5mL；④將含有淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至加有0.1mL注射用重組人細(xì)胞干擾素γ的培養(yǎng)瓶中，置37.0℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。⑤培養(yǎng)后的淋巴細(xì)胞混合液離心2000r/min，10min，棄去上清液，生理鹽水洗滌1次后稀釋至1mL，在妻子雙下臂內(nèi)側(cè)肘窩下緣行多點(diǎn)皮內(nèi)注射，每次每點(diǎn)注射0.1～0.2mL，30min后觀察局部情況；⑥每4周接種1次，連續(xù)接種3次為1個(gè)療程，治療期間避孕，接種3次后復(fù)查封閉抗體。

觀察指標(biāo)：兩組治療后封閉抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)情況；兩組中醫(yī)癥狀評(píng)分改善情況（按程度無(wú)、輕、中、重分級(jí),其對(duì)應(yīng)分值分別為0、1、2、3分）。采用尼莫地平法，即（治療前積分－治療后積分）/治療前積分×100%[12]。

3 治療結(jié)果

3.1 療效標(biāo)準(zhǔn) 痊愈：封閉抗體三項(xiàng)均轉(zhuǎn)陽(yáng),癥狀、體征消失或基本消失，癥狀積分減少≥95%；顯效：封閉抗體三項(xiàng)均轉(zhuǎn)陽(yáng)，癥狀、體征均有改善，癥狀積分減少≥70%；有效：封閉抗體一項(xiàng)或兩項(xiàng)轉(zhuǎn)陽(yáng)，癥狀、體征均有好轉(zhuǎn)，癥狀積分減少≥30%；無(wú)效：封閉抗體水平如治療前水平或更低，癥狀及體征無(wú)明顯改善，甚或加重，癥狀積分減少不足30%。

3.2 兩組臨床癥狀積分比較 兩組治療前癥狀積分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與治療前比較，免疫組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；安宮方組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.257，P＜0.01）；安宮方組治療后癥狀積分明顯低于免疫組（P＜0.0），見(jiàn)表1。

表1 兩組治療前后癥狀積分比較（分，±s）

表1 兩組治療前后癥狀積分比較（分，±s）

注：與治療前比較，*P＜0.01；與免疫組比較，△P＜0.05

組別免疫組安宮方組例數(shù)22 22治療前11.82±4.88 10.91±4.30治療后11.32±4.25 7.73±4.26*△

3.3 兩組實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 治療前兩組抗CD3－BE、抗CD4－BE、抗CD8－BE總陽(yáng)性數(shù)經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=－0.821，P=0.412）。治療后兩組含抗CD3－BE、抗CD4－BE、抗CD8－BE總陽(yáng)性數(shù)均有明顯提高（免疫組Z=－2.584，P=0.010，安宮方組Z=－3.531，P＜0.01）。安宮方組含抗CD3－BE、抗CD4－BE、抗CD8－BE的總陽(yáng)性數(shù)優(yōu)于免疫組（Z=－2.469，P =0.014），見(jiàn)表2。

表2 兩組治療前后封閉抗體陽(yáng)性數(shù)比較（例）

兩組治療前各封閉抗體抗CD－BE比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），治療后兩組各封閉抗體抗CD－BE均有明顯提高（免疫組抗CD3－BE治療前后比較t=－2.819，P=0.010；抗CD4－BE治療前后比較t=－2.112，P=0.047；抗CD8－BE治療前后比較t=－2.181，P=0.041，P均＜0.05）。安宮方組抗CD3－BE治療前后比較t=－2.751，P=0.012；抗CD4－BE治療前后比較t=－2.294，P=0.032；抗CD8－BE治療前后比較t=－3.731，P=0.001，P均＜0.05。但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見(jiàn)表3。

3.4 臨床療效比較 免疫治療組治愈1例，顯效6例，有效10例，無(wú)效5例，有效率77.27%；安宮方治療組治愈4例，顯效11例，有效4例，無(wú)效3例，有效率86.36%。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=－2.211，P=0.027）。安宮方治療組治療效果優(yōu)于免疫治療組。但兩組總體有效率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（校正χ2=0.153，P=0.696）。

4 討論

現(xiàn)代生殖免疫學(xué)認(rèn)為，胎兒1/2的基因來(lái)源于父系，因此正常妊娠是一種成功的半同體移植。引起免疫學(xué)異常的RSA分為兩大類(lèi)，即自身免疫型RSA和同種免疫型RSA[13]。自身免疫包括抗磷脂抗體（APA）、抗核抗體（ANA）、抗精子抗體（ASA）、抗子宮內(nèi)膜抗體（EMA）等[14]。同種免疫型RSA主要表現(xiàn)為封閉抗體缺乏[15]。正常孕產(chǎn)婦血清中的封閉抗體主要由胚胎表面人類(lèi)白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）以及主要表達(dá)于滋養(yǎng)層的淋巴細(xì)胞交叉反應(yīng)抗原（trophoblast－lympholta crossreactivity，TLX）而產(chǎn)生的，可通過(guò)與相應(yīng)的抗原結(jié)合而防止胚胎父系抗原被母體免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺傷，從而維持妊娠[16]。目前我院檢測(cè)患者血清BA主要對(duì)配偶外周血T淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8的抗原反應(yīng)。研究表明，如果滋養(yǎng)葉細(xì)胞無(wú)法有效表達(dá)CD3相關(guān)的TLX抗原，則減弱對(duì)CD3抗原的生理性刺激。CD3抗原對(duì)T細(xì)胞的內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)具有增強(qiáng)活化作用，從而有利于正常母胎免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的建立。CD4抗原能增強(qiáng)TCR－CD3對(duì)主要組織相容性抗原系統(tǒng)（MHC）－II類(lèi)抗原的結(jié)合，CD8抗原有助于介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞損傷靶抗原。目前針對(duì)BA缺乏的主要手段是主動(dòng)免疫治療即通過(guò)提取患者配偶淋巴細(xì)胞后多點(diǎn)注射至患者皮內(nèi)使之產(chǎn)生具有保護(hù)胚胎免受免疫攻擊的抗體[17]。國(guó)外研究[18]報(bào)道，主動(dòng)免疫治療有效率約87%～96%，國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道有效率約為87%，本研究為77.27%。但主動(dòng)免疫治療有過(guò)敏反應(yīng)、傳染?。ǜ窝住⒕藜?xì)胞病毒、艾滋病）傳播及促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移等風(fēng)險(xiǎn)，且痛苦大，不易被接受。

RSA屬中醫(yī)“滑胎”范疇。中醫(yī)認(rèn)為，腎為先天之本，生殖的根本。脾為后天之本，氣血生化之源，其運(yùn)化的水谷精氣為免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)。若腎虛或脾腎不足，氣血虛弱或宿有癥瘕之疾，傷及沖任均可導(dǎo)致胎元不固而致滑胎。結(jié)合臨床觀察筆者認(rèn)為，封閉抗體低下型RSA的主要證型為脾腎虧虛兼血瘀。安宮方為浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科治療RSA的有效驗(yàn)方，其中太子參、黃芪、白術(shù)、茯苓具有健脾作用。藥理研究[19]表明，太子參75%醇提物能對(duì)環(huán)磷酰胺（Cy）所致T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能低下，白細(xì)胞吞噬功能降低及遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH）減弱有明顯對(duì)抗作用；黃芪含有的多糖、皂苷、黃酮等能增強(qiáng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[20]；Lee等[21]研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)能刺激Th1型淋巴細(xì)胞增殖，產(chǎn)生抗體，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。川斷、槲寄生、菟絲子為壽胎丸加減，具有補(bǔ)腎安胎作用。萸肉中多糖類(lèi)成分能增強(qiáng)免疫功能，提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬百分率[22]。當(dāng)歸、丹參、紅花具有活血化瘀作用，其中當(dāng)歸中的主要水溶性成分當(dāng)歸多糖能激活T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，并增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用[23]。丹參具有雙向免疫調(diào)節(jié)功效，主要通過(guò)免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子、抗體及免疫復(fù)合物而發(fā)揮作用[24]。紅花水煎液對(duì)小鼠的非特異性免疫功能及細(xì)胞免疫功能均有明顯的增強(qiáng)作用，提高單核細(xì)胞的吞噬能力[25]。炙甘草為使藥，調(diào)和藥味。諸藥合用補(bǔ)益脾腎，養(yǎng)血活血，調(diào)節(jié)免疫，促進(jìn)封閉抗體提高，改善脾腎虧虛血瘀諸癥，從而達(dá)到治療效果。

表3 兩組治療前后抗CD3－BE、抗CD4－BE、抗CD8－BE水平比較（±s）

表3 兩組治療前后抗CD3－BE、抗CD4－BE、抗CD8－BE水平比較（±s）

組別免疫組安宮方組P抗CD8－BE例數(shù) 抗CD3－BE P 抗CD4－BE P 2 2 2 2治療前－0.33±2.54－0.74±2.12治療后1.67±2.44 0.93±1.93 0.010 0.012 0.570治療前－1.41±2.04－0.19±2.02治療后－0.10±1.96 1.09±1.12 0.047 0.032治療前0.23±2.24－0.79±2.24 0.053治療后1.34±1.74 1.09±1.03 0.141 P 0.041 0.001

本研究?jī)山M治療后均能提高封閉效率，安宮方組總有效率86.36%，免疫治療組為77.27%。同時(shí)安宮方能顯著改善患者的臨床癥狀。

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（收稿：2014-09-12 修回：2014-11-21）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)（杭州 310053）；2浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科（杭州 310003）

丁彩飛，Tel：13588810881