王 海周 蕾許丹丹

·經(jīng)驗交流·

肝硬化患者網(wǎng)織血小板與血小板參數(shù)之間的相關(guān)性及臨床意義

王 海1周 蕾2許丹丹1

肝硬化；網(wǎng)織血小板；血小板；大血小板比率

網(wǎng)織血小板（reticulated platelets，RP）是骨髓巨核細胞近期釋放入外周血的未成熟細胞[1]，僅含少量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和mRNA，不含DNA或核的成分，因此具有合成少量蛋白質(zhì)的能力，其代表血循環(huán)中最年輕的血小板。與正常血小板相比較，RP的體積大，胞漿內(nèi)含有少量mRNA，具有更強的活性[2]；因此測定外周血RP可以比較精確地反映骨髓血小板生成情況[3]。血小板的平均體積（MPV）代表單個血小板的平均體積，常用來評價骨髓功能；血小板分布寬度（PDW）是反映血小板體積大小是否均勻的參數(shù)，PLCR反映大血小板比率。有文獻[4]報道，血小板參數(shù)與體外血小板功能有較好的相關(guān)性，可間接反映血小板功能狀況。本研究通過對肝硬化患者和慢性肝炎患者外周血中網(wǎng)織血小板與血小板參數(shù)進行測定，以揭示肝硬化患者血小板變化的原因，并對網(wǎng)織血小板百分比（RP%）與血常規(guī)血小板參數(shù)（PLT、MPV、PDW及P－LCR）的相關(guān)關(guān)系進行探討。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集浙江省立同德醫(yī)院2013年4月健康體檢者20名為對照組，其中男9名，女11名，年齡20歲～62歲，血小板計數(shù)（100～300）×109/L。2013年1～4月住院診斷明確的慢性肝炎患者42例為慢性肝炎組，其中輕度18例，中度15例，重度9例；男23例，女19例，年齡18～65歲。同期住院診斷明確的肝硬化患者30例為肝硬化組，男18例，女12例，年齡36～72歲。

1.2 診斷標準 入選慢性肝炎組和肝硬化組的患者的診斷均符合2000年西安全國肝炎會議《病毒性肝炎防治方案》的診斷標準[5]；均經(jīng)血清學檢查排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒感染。

1.3 儀器與試劑 RP測定采用美國BeckmanCoulter公司Epics XL型流式細胞儀，應用SYSTEMⅡSoftware獲取和分析試驗數(shù)據(jù)，噻唑橙（TO）和CD 41b單抗（PE標記）購自蘇州聯(lián)科公司。PLT計數(shù)及MPV及PDW、P－LCR的測定采用Sysmex XE－1200型全自動血細胞分析儀及原廠配套試劑（日本Sysmex公司）。

1.4 方 法

1.4.1 標本采集 符合上述要求的個體，均在治療前采集5mL靜脈血，2mL注入乙二胺四乙酸二鉀（EDTA－K2）抗凝的真空采血管，充分混勻，立即在血球計數(shù)儀上測定PLT、MPV、PDW、P－LCR。將同一份標本500r/min離心5min，分離出上清，加入TES，離心（2000r/min，10min），然后棄上清，制成富含血小板的血漿（RPR）。取兩支FCM專用試管，都加入20μL PRP，50μLPBS和10μL CD41－PE單抗，混勻后室溫避光孵育20min；一支加入1mL PBS作為對照管，另一支加入1mL濃度為20μg/L的TO試劑作為測定管，室溫孵育30min后上流式細胞儀進行測定。剩余的3mL注入無抗凝劑的真空采血管，2h內(nèi)離心（3000r/min，10min）分離非溶血的血清，行生化項目檢測。

1.4.2 標本測定 用Sysmex XE－1200血細胞分析儀及原廠配套試劑（日本Sysmex公司）測定PLT、MPV、PDW、P－LCR。用美國Beckman Coulter公司Epics XL型流式細胞儀檢測RP占PLT的百分比（RP%），RP絕對值為血小板總數(shù)乘以RP%。參考Matic等[6]描述的設門策略，檢測對照管和測定管，使對照管中99%的血小板位于陰性區(qū)來確定陽性閾值，共檢測20 000個血小板，識別標本TO陽性的RP百分比，以RP%表示。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，對于符合正態(tài)性分布的數(shù)據(jù)以（±s）表示，三組均數(shù)比較F檢驗，兩組間比較采用t檢驗；相關(guān)性檢驗用Pearson直線相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的臨床特征及實驗室檢查分析 記錄各組的臨床特征，并檢測各組血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、白蛋白（Alb）、總膽紅素（TB），并計算白球比（A/G）。對慢性肝炎組、肝硬化組和對照組三組之間進行單因素方差分析，各組間年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而各組之間血清ALT、AST、Alb、TB水平以及A/G比值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.2 各組PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP絕對值結(jié)果分析 檢測慢性肝炎組、肝硬化組和對照組PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP絕對值，對三組之間進行單因素方差分析，結(jié)果顯示三組間PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP絕對值差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，慢性肝炎組PLT降低，MPV、PDW、P－LCR升高（t=－2.51，3.09，4.09，3.61，P＜0.05），肝硬化組PLT、RP%、RP絕對值降低，P－LCR升高（t=－6.13，－6.31，－7.54，2.56，P＜0.05）；與慢性肝炎組比較，肝硬化組PLT、RP%、RP絕對值降低（t=－3.45，－4.04，－4.72，P＜0.05）。見表2。

2.3 三組RP%和PLT、MPV、PDW、P－LCR相關(guān)性分析 對三組RP%與PLT之間進行相關(guān)分析，結(jié)果三組RP%與PLT之間均無相關(guān)關(guān)系（r=－0.062，－0.049，－0.037，P＞0.05）；三組RP%與MPV、PDW、P－LCR之間呈相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）。見表3。

3 討論

肝硬化患者多伴有血小板變化，這種變化既有血小板功能的改變，又有血小板數(shù)量的變化。多年來，人們一直認為肝硬化血小板減少的原因是由于脾功能亢進；然而,一些行脾切除術(shù)或TIPS降門靜脈壓力患者的血小板也會持續(xù)低于正常標準，因此，脾亢并不能完全解釋肝硬化患者血小板減少的機制[7]。

外周血RP水平被認為是反映體內(nèi)血小板生成能力的指標，通過測定外周血中RP的數(shù)量和RP%可以有效的鑒別血小板降低的原因；而PLT、MPV、PDW、P－LCR是反應血小板功能的參數(shù)；MPV反映血小板體積大小，可用于血小板減少原因的鑒別。若血小板破壞增多而引起血小板減少時，MPV增大；若骨髓受損導致血小板減少時，MPV減小。另外血栓前狀態(tài)，MPV常增大，特別在血小板聚集期，并隨其聚集速率和程度增加而MPV增加[8]。PDW升高說明血小板大小不一，通常MPV增大，PDW也增大；P－LCR升高，提示血小板代謝活躍，黏附力與聚集力相對較強大。RP%和PLT、MPV、PDW、P－LCR同時檢測，有助于了解慢性肝病患者血小板變化的原因。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，慢性肝炎患者RP%略高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；RP絕對計數(shù)值略低于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義；而MPV、PDW、P－LCR顯著升高（P＜0.05）；這與岳彩娟等[9]報道一致。說明慢性肝炎患者并無血小板生成障礙，而導致血小板降低的原因可能性是破壞過多，一般認為與脾臟的吞噬、血小板相關(guān)抗體的存在等有關(guān)。也有研究認為，血小板相關(guān)免疫球蛋白介導的破壞也可能是慢性肝炎患者血小板數(shù)目減少血小板減少的原因之一[10]。肝硬化患者RP絕對計數(shù)值和RP%均顯著低于正常對照（P＜0.05），與Michur等[11]報道的結(jié)果基本一致；而肝硬化患者的MPV、PDW略高于正常對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PLCR顯著升高（P＜0.05）；其原因可能主要有二：一是由門脈高壓導致脾功能亢進而致血小板破壞增多，二是由于肝細胞受損而導致由肝細胞分泌的血小板生成素（TPO）減少[12]，則作用于巨核細胞的TPO的量也就越少，生成的網(wǎng)織血小板減少，血小板生成障礙所致[13]。有研究[14]表明，若血小板破壞增多而引起血小板減少時，MPV增大；若骨髓生成受損導致血小板減少時，MPV減??；這與本文所得慢性肝炎患者血小板降低與血小板破壞過多有關(guān)的結(jié)論是一致的。而肝硬化患者的MPV與正常對照組無顯著性差異，可能是由于血小板破壞增多而引起血小板MPV增大和骨髓生成受損導致血小板MPV減小雙重作用造成的結(jié)果。RP%與PLT之間無相關(guān)關(guān)系，而RP%與MPV、PDW、P－LCR之間均具有良好相關(guān)性。我們在RP%與PDW及P－LCR相關(guān)性分析顯示，隨著PDW及P－LCR增大，RP%同樣出現(xiàn)上升趨勢。血小板總數(shù)是檢測外周血血小板濃度的參數(shù)，與RP%之間無相關(guān)關(guān)系。MPV與RP%均是反映骨髓血小板生成的指標，雖MPV與RP%之間呈正相關(guān)關(guān)系，但不存在一一對應關(guān)系；這可能由于MPV受小紅細胞、紅細胞碎片及大血小板的干擾較大，許多情況下不能反映血小板實際體積的大小。而檢測RP%時采用TO/ anti CD41雙標法，可以有效去除小細細胞、紅細胞碎片及大血小板的干擾，使RP%能夠更好地反映骨髓巨核細胞的生成狀態(tài)。

表1 各組一般資料及臨床特征比較（±s）

表1 各組一般資料及臨床特征比較（±s）

組別對照組慢性肝炎組肝硬化組F值P值例數(shù)20 42 30年齡（歲）38.5±9.9 37.2±11.3 40.3±12.5 0.64 0.53 ALT（U/L）28.5±8.5 108.6±40.5 168.5±54.6 67.59 0.000 AST（U/L）23.4±8.8 89.8±43.5 152.6±53.5 55.78 0.000 Alb（g/L）44.6±4.7 39.0±7.8 30.8±9.8 19.12 0.000 A/G 1.4±0.2 1.3±0.3 0.9±0.2 31.04 0.000 TB（μmol/L）9.4±4.1 46.4±21.2 109.1±44.7 76.11 0.000

表2 各組PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP絕對值比較（±s）

表2 各組PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP絕對值比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與慢性肝炎組比較，△P＜0.05

RP 2.96±0.86 2.35±1.26 1.10±0.85*△21.05 0.000組別對照組慢性肝炎組肝硬化組F值P值例數(shù)20 42 30 PLT（×109/L）203.10±50.03 163.86±60.63* 18.33±46.40*△89.91 0.000 MPV（fL）9.63±0.98 10.56±1.16* 10.26±1.20 4.53 0.012 PDW 16.05±0.72 16.92±0.81* 16.58±1.73 3.84 0.025 P－LCR（%）17.33±5.49 24.80±8.42* 22.20±7.22* 6.74 0.001 RP% 2.15±0.45 2.59±1.83 1.19±0.58*△10.20 0.000

表3 各組RP%和PLT、MPV、PDW、P－LCR相關(guān)關(guān)系結(jié)果

總之，同時檢測肝硬化患者外周血PLT、MPV、PDW、P－LCR、RP%可以更好揭示肝硬化患者血小板變化的原因，并且RP%較MPV可更為精確地反映骨髓血小板生成情況,值得臨床推廣應用。

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（收稿：2014－09－01 修回：2014－11－07）

浙江省公益技術(shù)應用研究項目（No.2013C37066）

1浙江省立同德醫(yī)院檢驗科（杭州 310012）；2杭州市兒童醫(yī)院檢驗科（杭州 310003）

王海，E－mail：wanghai.5188@163.com