應(yīng)廣宇 陳 高

蔓荊子黃素對(duì)垂體瘤細(xì)胞GH3增殖抑制作用研究

應(yīng)廣宇 陳 高

目的 觀察蔓荊子黃素（vitexicarpin）對(duì)GH3垂體瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響，探討其作用機(jī)制。方法 通過繪制含不同濃度梯度的Vitexicarpin培養(yǎng)基條件GH細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，觀察Vitexicarpin對(duì)GH3細(xì)胞的作用；應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測(cè)Vitexicarpin作用后的劑量時(shí)間效應(yīng)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率以及Western Blotting測(cè)定PARP、Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果

垂體瘤；Vitexicarpin；GH3細(xì)胞系；凋亡

垂體瘤是起源于垂體前葉和垂體后葉及顱咽管上皮殘余細(xì)胞的腫瘤，是最為常見的鞍區(qū)腫瘤，在顱內(nèi)腫瘤中僅次于膠質(zhì)細(xì)胞瘤和腦膜瘤，約占顱內(nèi)腫瘤的9.6%[1]，由于腫瘤的占位效應(yīng)和激素分泌異常導(dǎo)致一系列臨床癥狀，嚴(yán)重影響患者的身心健康。目前臨床上常用的治療方法包括手術(shù)治療、藥物治療、放射治療等。手術(shù)作為垂體瘤的首選治療方案，但是完全切除腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)較高，同時(shí)術(shù)后可能出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥[2]。放射治療也是常規(guī)治療，用于縮小腫瘤體積，減少激素分泌。其缺點(diǎn)是會(huì)產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的垂體功能減退[3]。隨著多巴胺受體激動(dòng)劑（如溴隱亭）以及生長(zhǎng)抑素類似物的臨床應(yīng)用，垂體瘤藥物治療取得較為滿意的療效。但是，一項(xiàng)數(shù)據(jù)表明，目前仍然10%左右的患者存在不同程度的耐藥問題[4]。因此，是否能找到一種治療垂體瘤的新藥物，成為研究人員新的方向。近期的多項(xiàng)研究表明，蔓荊子黃素（Vitexicarpin）對(duì)多種腫瘤細(xì)胞如乳腺癌細(xì)胞系MN1、人鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系A(chǔ)431、白血病細(xì)胞系K562[5-8]具有一定的抑制作用。本研究通過Vitexicarpin對(duì)垂體瘤細(xì)胞系GH3的體外研究，探討Vitexicarpin對(duì)垂體瘤的治療作用以及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 Vitexicarpin購(gòu)于杭州達(dá)文生物有限公司；GH3細(xì)胞系購(gòu)于北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心；CCK－8試劑盒（Cell Counting Kit－8）購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所，Anti－PARP antibody（ab32138）、Anti－active +pro Caspase 3 antibody（ab47131）購(gòu)于abcam公司；羊抗兔IgG－HRP、羊抗小鼠IgG－HRP購(gòu)于美國(guó)Pierce公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) GH3細(xì)胞系用F－10培養(yǎng)基，內(nèi)含15%馬血清+2.5%胎牛血清，100μg/mL青霉素以及100μg/mL鏈霉素，在37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)。對(duì)照組和藥物作用組細(xì)胞均使用含血清的培養(yǎng)基處理。實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率測(cè)算 采用CCK－8法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將GH3細(xì)胞系以2×105/mL細(xì)胞濃度，接種于96孔板中，100μL/孔每個(gè)劑量平行設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。等貼壁細(xì)胞于24h后分別加入濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0μmol/L的 Vitexicarpin。對(duì)照組加入相同濃度的DMSO，分別在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72h；每孔加入10μL的CCK－8試劑在37℃，5%CO2的條件下反應(yīng)3h。用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的OD值。按如下公式計(jì)算細(xì)胞活力：樣品組平均OD值／空白對(duì)照組平均OD值×100%。相同實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。由于GH3細(xì)胞系呈特定的半貼壁半懸浮生長(zhǎng)，測(cè)定細(xì)胞活力時(shí)不宜吸取上清，故實(shí)驗(yàn)中選用CCK－8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取指數(shù)生長(zhǎng)期的GH3細(xì)胞以3×105/mL接種于6孔板內(nèi)2mL/孔，設(shè)空白對(duì)照組和處理組置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入濃度10.0μmol/L的Vitexicarpin，對(duì)照組加入相同濃度DMSO，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在二氧化碳培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)0、24、48、72h后，用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化細(xì)胞，收集各孔懸浮在培養(yǎng)液中的細(xì)胞及貼壁細(xì)胞。預(yù)冷PBS洗2次，以1×binding buffer制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為0.5～1×106/mL。取100μL（約1×105個(gè)細(xì)胞）置流式管中，加PI和FITC標(biāo)記的Annexin－V 5μL，混勻后室溫下避光孵育15min。每管中再加入1×Binding Buffer 400μL，充分混合后流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況（盡快在1h內(nèi)檢測(cè)）。

1.5 PARP、Caspase－3測(cè)定 采用蛋白質(zhì)印跡反應(yīng)（Western Blotting）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將GH3細(xì)胞系以3×105/mL細(xì)胞濃度，接種于25cm2培養(yǎng)瓶中6mL/瓶；設(shè)空白對(duì)照組和處理組，處理組加入20.0μmol/L的Vitexicarpin，對(duì)照組加入相同濃度的DMSO，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別作用24、48、72h后離心收集藥物處理后的GH3細(xì)胞，用冷的PBS清洗2遍。采用T－PER Tissue Protein Extraction Reagent（含Protease Inhibitor Cocktail）進(jìn)行6個(gè)細(xì)胞總蛋白的提取，然后采用BCA定量試劑盒（碧云天生物科技有限公司）進(jìn)行總蛋白定量。配制8%分離膠和5%濃縮膠，每個(gè)孔60μg總蛋白進(jìn)行上樣，每孔12μL，濃縮膠60V，分離膠80V進(jìn)行電泳3h左右（PARP 4.5h左右）。PVDF膜甲醇中浸泡20s，然后轉(zhuǎn)移到Tris－Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液（15%甲醇）（PARP轉(zhuǎn)移緩沖液含5%甲醇）中平衡至少5min；SDS－PAGE膠在Tris－Glycine轉(zhuǎn)移緩沖液平衡至少30min；在冷卻條件下以100V恒壓轉(zhuǎn)膜2h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，放到TTBS（含5%脫脂奶粉）室溫封閉1h，然后T－TBS漂洗，5min×3；一抗以1∶1000比例溶于T－TBS（含2%脫脂奶粉），4℃孵育過夜；然后T－TBS漂洗5min×4；內(nèi)參β－actin以1∶1000溶于一抗稀釋液中；二抗采用羊抗兔IgG－HRP以1∶8000溶于T－TBS（含2%脫脂奶粉），室溫1h，然后T－TBS漂洗5min×5；內(nèi)參βactin采用羊抗小鼠IgG－HRP以1∶10 000溶于二抗稀釋液中；采用SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate，按說明書操作，制備約1mL ECL工作液，室溫孵育轉(zhuǎn)印膜1min，然后去除多余ECL試劑，保鮮膜密封，暗盒中放上X－film曝光5～10min后進(jìn)行顯影和定影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組計(jì)量資料采用非獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Vitexicarpin對(duì)GH3細(xì)胞系增殖的影響 藥物作用24h后觀察細(xì)胞活力，當(dāng)濃度達(dá)到2.5μmol/L時(shí)，可見到明顯的細(xì)胞抑制現(xiàn)象；藥物作用于細(xì)胞系48、72h后，當(dāng)濃度達(dá)到1.5μmol/L即可觀察到明顯的細(xì)胞抑制現(xiàn)象；使用3.0μmol/L的Vitexicarpin作用GH3細(xì)胞系中，其24、48、72h的細(xì)胞活力分別在82.4%、57.8%、38.6%，提示Vitexicarpin對(duì)GH3細(xì)胞系的增殖具有抑制作用，且呈濃度及時(shí)間依賴性（見圖1）。

2.2 Vitexicarpin對(duì)GH3細(xì)胞凋亡的影響 10μmol/ L的Vitexicarpin作用于3×105/mL細(xì)胞濃度，2mL/孔的6孔培養(yǎng)板中，分別作用0、24、48、72h后，流式細(xì)胞儀統(tǒng)計(jì)凋亡率[AV（+）PI（－）]為凋亡細(xì)胞。當(dāng)出現(xiàn)AV（+）PI（-）時(shí)為細(xì)胞凋亡，當(dāng)出現(xiàn)AV（+）PI（+）時(shí)為細(xì)胞死亡。結(jié)果顯示，當(dāng)一定濃度（10μmol/L）的Vitexicarpin作用于GH3細(xì)胞系，其24h凋亡率為（10.8±0.9）%，48h凋亡率為（16.8±0.6）%，而72h凋亡率為（29.8±1.6）%，雖然因?yàn)闀r(shí)間的增加死亡的細(xì)胞率也有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各時(shí)間點(diǎn)均有凋亡細(xì)胞增加，但是僅在作用72h后，細(xì)胞的凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2）。

圖1 Vitexicarpin抑制GH3細(xì)胞系增殖

圖2 Vitexicarpin對(duì)GH3細(xì)胞凋亡的影響

2.3 Vitexicarpin對(duì)caspase-3活性的影響 20μmol/ L Vitexicarpin處理24、48、72h的GH3細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果顯示，Vitexicarpin可以使32kD的Caspase-3剪切成17kD和12kD兩個(gè)活性片段，PARP也由原來的116kD被剪切成85kD的片段。說明Vitexicarpin可能是通過激活Caspase-3活性，裂解PARP，從而啟動(dòng)凋亡程序（見圖3）。

3 討論

目前，多數(shù)研究認(rèn)為蔓荊子主要通過下列兩種途徑發(fā)揮抗腫瘤活性：第一，蔓荊子中的某些細(xì)胞毒性成分發(fā)揮作用，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，干擾DNA合成，抑制細(xì)胞增殖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；第二，蔓荊子中活性成分可能通過阻止細(xì)胞分裂，形成周期阻滯[9-10]。

圖3 Vitexicarpin對(duì)Procaspase-3、cleaved-caspase-3、PARP、cleaved-PARP蛋白的表達(dá)的影響1：24h對(duì)照組；2：24h處理組；3：48h對(duì)照組；4：48h處理組；5：72h對(duì)照組；6：72h處理組；

本研究應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)Vitexicarpin對(duì)GH3細(xì)胞系在不同濃度不同時(shí)間的抑制活性，發(fā)現(xiàn)它對(duì)體外生長(zhǎng)的垂體瘤細(xì)胞抑制作用存在明顯的劑量和時(shí)間效應(yīng)，進(jìn)而進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)中凋亡細(xì)胞特有的AV（+）PI（-）特征，測(cè)定出在一定濃度的Vitexicarpin作用下GH3細(xì)胞呈現(xiàn)特有凋亡特征。因此，認(rèn)為誘導(dǎo)凋亡為Vitexicarpin抑制GH3細(xì)胞增殖作用的一種重要機(jī)制。應(yīng)用蛋白印跡的方法檢測(cè)Vitexicarpin對(duì)GH3細(xì)胞系中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Caspase-3和PARP均被剪切，從而進(jìn)一步證實(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡為Vitexicarpin對(duì)體外生長(zhǎng)的垂體瘤細(xì)胞發(fā)生抑制作用的機(jī)制之一。

凋亡是發(fā)生在細(xì)胞中的一種受良好控制的程序性細(xì)胞死亡[11]，Caspase信號(hào)通路是細(xì)胞凋亡發(fā)生中重要的機(jī)制，通過活化下游的Caspase或者底物，啟動(dòng)并且傳遞鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[12]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡中重要的功能蛋白酶，凋亡細(xì)胞內(nèi)，32kD的原酶裂解為17kD和12kD的亞單位，兩個(gè)亞單位組成二聚體，即活化的Caspase-3，活化的Caspase-3進(jìn)一步水解活化其它Caspase酶及胞漿內(nèi)目標(biāo)（如D4-GDI）和核內(nèi)目標(biāo)（如PARP）[13]。多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（PARP）是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志性核內(nèi)底物，它參與DNA的修復(fù)及基因的整合，另外也能抑制與細(xì)胞凋亡晚期核小體間染色體的斷裂有關(guān)的Ca2+/M92+依賴性核酸內(nèi)切酶的活化。它的降解打破了細(xì)胞的平衡狀態(tài)，細(xì)胞因此不能進(jìn)行正常的生理活動(dòng)，核酸內(nèi)切酶的活化又促成了核內(nèi)DNA的斷裂，從而使細(xì)胞走向凋亡[11]。本研究通過Vitexicarpin作用的GH3細(xì)胞，發(fā)生Caspase-3和PARP均被剪切現(xiàn)象，Caspase-3的剪切表明經(jīng)典凋亡的共同通道——天冬氨酸特異性半胱氨酸酶（caspase）級(jí)聯(lián)反應(yīng)啟動(dòng)了；而PARP的剪切表明，其級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最終底物為PARP，通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終使細(xì)胞核內(nèi)打破細(xì)胞的平衡，促使核內(nèi)DNA的斷裂，使細(xì)胞最終走向凋亡。

Vitexicarpin不僅能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生抗腫瘤作用，還能通過周期抑制、抑制有絲分裂活動(dòng)機(jī)制產(chǎn)生作用[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，在48h或者72h時(shí)間段，即使Vitexicarpin的作用濃度為5μmol/L，其對(duì)細(xì)胞的抑制率仍然能達(dá)到53.8%和66.6%，對(duì)比同時(shí)間段，高濃度的Vitexicarpin（10μmol/L）對(duì)細(xì)胞的凋亡率分別為16.8%和29.8%，這說明Vitexicarpin對(duì)GH3細(xì)胞的增殖抑制作用，不僅是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，也可能通過多種機(jī)制發(fā)揮復(fù)合作用。Vitexicarpin對(duì)GH3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，除了促進(jìn)凋亡，還存在哪些方面的機(jī)制，仍然是我們下一步研究的目標(biāo)。

綜上所述，線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是Vitexicarpin抑制垂體瘤體外細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制之一。本研究結(jié)果表明它有可能成為新一種治療垂體瘤的中藥活性成分，具有較大的開發(fā)價(jià)值，但目前的研究還僅限于淺顯的體外實(shí)驗(yàn)階段，其在體內(nèi)對(duì)細(xì)胞的影響還有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿：2014-10-24 修回：2014-10-28）

Inhibitory Effect of Vitexicarpin on Proliferation of Pituirary Adenoma GH3 Cells

YING Guangyu,CHEN Gao.Department of Neurosurgery,the Second Affiliated Hospital,Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou (310009),China

Objective To investigate the anti-proliferation effect of vitexicarpin on pituitary adenoma GH3 cells and explore the molecular mechanism.Methods The proliferation of GH3 cells treated with different solubility gradients of vitexicarpin was evaluated by drawing the cell viability curve.CCK-8 method was used to evaluate the time-and dose-dependent effects of vitexicarpin.The effect of vitexicarpin on GH3 cell apoptosis and the change of apoptotic protein PARP,Caspase 3 were determined by using flow cytometer and western blot,respectively.Results Vitexicarpin inhibited the growth and proliferation of GH3 cells in a time-and dose-dependent manner.Flow cytometry showed that vitexicarpin promoted GH3 cell apoptosis;western blot results found that caspase-3 was activated and PARP was degradated after vitexicarpin treatment.Conclusion Vitexicarpin can inhibit proliferation of pituitary adenoma GH3 cells partly via mitochondria-dependent apoptosis.

pituitary adenoma;Vitexicarpin;GH3 cells;apoptosis

浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2009CA065）

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科（杭州310009）

陳高，E-mail：yinggy1983@163.com；Tel：13777834056

Vitexicarpin可以抑制GH3細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，這種抑制作用有明顯的劑量和時(shí)間效應(yīng)，流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示其抑制增殖作用是通過誘導(dǎo)GH3細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)，Western Blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Caspase-3活化，PARP裂解。結(jié)論 Vitexicarpin可以抑制GH3垂體腺瘤細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能是通過線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路。