黃 蕾，許克寒，吳俊琪，姚 闊，俞世沖，吳秋業(yè)（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433）

·綜述·

炭疽桿菌表面四糖抗原全合成的研究進(jìn)展

黃 蕾，許克寒，吳俊琪，姚 闊，俞世沖，吳秋業(yè)（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433）

炭疽是由炭疽桿菌引起的人畜共患的傳染病。炭疽桿菌屬于需氧芽孢桿菌屬，為G＋菌，其病原體是芽孢。炭疽芽孢最外層含有特定結(jié)構(gòu)的四糖抗原，可用于制備糖綴合物疫苗，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。綜述近10年來(lái)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)炭疽四糖化學(xué)合成的研究進(jìn)展，并結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新研究成果介紹各條制備路線，比較各種方法的主要優(yōu)缺點(diǎn)。

炭疽四糖；糖基化；化學(xué)合成

1 前言

炭疽是由炭疽桿菌引起的人畜共患的傳染病。炭疽桿菌為致病菌中最大的G＋菌，屬于需氧芽孢桿菌屬［1］。該菌在宿主體內(nèi)形成莢膜，莢膜具有很強(qiáng)的致病性和抗吞噬作用。炭疽桿菌在體外可形成芽孢，芽孢具有很強(qiáng)的抵抗力，可在動(dòng)物尸體及土壤中存活數(shù)十年［2］。一旦它進(jìn)入人體，炭疽芽孢便會(huì)迅速繁殖并釋放出毒力很強(qiáng)的外毒素和莢膜物質(zhì)，引起組織水腫、出血和壞死，使人喪失勞動(dòng)力，直至死亡。該菌具有強(qiáng)大的殺傷力，能夠承受惡劣的生長(zhǎng)環(huán)境，并且易于擴(kuò)散，炭疽孢子在歷史上曾被許多國(guó)家和恐怖組織用于制造大規(guī)模殺傷性武器。目前治療炭疽的首選藥物是抗生素，然而炭疽毒素對(duì)抗生素并不敏感，所以對(duì)于中晚期炭疽患者，臨床醫(yī)生幾乎束手無(wú)策［3］。由此可見(jiàn)，有效的抗炭疽疫苗具有重大的臨床價(jià)值［4］。

由于糖基化是生命過(guò)程中普遍存在的現(xiàn)象，而承載重要生物學(xué)功能的糖綴合物的糖鏈在病理過(guò)程中的異常和高表達(dá)以及異種生物糖鏈的特異性，使糖類化合物作為抗原決定簇而引起特異性免疫反應(yīng)?；诖碎_(kāi)發(fā)的一系列常用寡糖疫苗［5］能夠在感染的早期階段起到滅活細(xì)菌的作用，并在臨床實(shí)踐中被證實(shí)是有效和安全的。另外，癌癥［6］、瘧疾［7］和b型流感病毒［8］等的寡糖疫苗合成工作也已取得了令人鼓舞的進(jìn)展。

2004年，Turnbough報(bào)道了炭疽芽孢表面四糖抗原anthrose（圖1）的特異性結(jié)構(gòu)：由3個(gè)L-鼠李糖和一個(gè)D-單糖組成，且含有一個(gè)非還原性末端［9］。炭疽四糖1結(jié)構(gòu)的闡明，為發(fā)展炭疽疫苗提供了新的靶標(biāo)抗原和分子基礎(chǔ)。炭疽芽孢最外層上的寡糖抗原具有高度保守性結(jié)構(gòu)和免疫應(yīng)答的可靠性［9］，可與不同的蛋白載體結(jié)合，用于開(kāi)發(fā)新型的糖綴合物疫苗［10］。由于細(xì)胞表面的寡糖往往難以由分離得到，所以尋找有效的炭疽四糖1及其類似物的化學(xué)合成方法尤為重要。本文綜述近10年來(lái)對(duì)炭疽四糖化學(xué)合成研究進(jìn)展的文獻(xiàn)報(bào)道，并結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新研究成果，介紹了各條路線的制備機(jī)制，比較了各種方法的主要優(yōu)缺點(diǎn)。

圖1 炭疽四糖1、2、3、5的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

2 合成路線

2.1［2＋2］路線 2005年9月，Seeberger［11］報(bào)道采用［2＋2］的策略首次合成了anthrose類似物炭疽四糖2（圖1）。炭疽四糖2的末端含有戊烯基，在開(kāi)發(fā)疫苗過(guò)程中可作為連接點(diǎn)綴合載體蛋白。此路線（圖2）以L-鼠李糖和D-巖藻糖為原料，分別修飾成單糖中間體11、12、13和14。單糖13和14在三氟甲磺酸三甲基硅酯（TMSOTf）催化下，糖基化后與吡啶反應(yīng)脫去Fmoc基團(tuán)得二糖中間體16。單糖11和12在TMSOTf催化下進(jìn)行β-選擇性糖基化后，在MeI／Ag2O催化下甲基化得二糖中間體15。二糖中間體15在TMSOTf催化下與Cl3CCN、NaH反應(yīng)得二糖中間體17。二糖中間體16和17在TMSOTf催化下糖基化，［2＋2］耦合得四糖中間體18。最后，四糖中間體18與液氨中的鈉反應(yīng)脫去所有的永久保護(hù)基團(tuán)，疊氮部分轉(zhuǎn)化成胺，得目標(biāo)產(chǎn)物。合成路線總體步驟較短，相對(duì)快捷，方便獲取類似物和短序列；但由于D-巖藻糖價(jià)格較貴，并不適合實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。

2.2以鼠李糖和葡萄糖為原料的［1＋3］路線 2005年10月，Kovac［12］課題組，報(bào)道采用［1＋3］的策略合成了anthrose類似物炭疽四糖苷3（圖1）。炭疽四糖苷3的末端側(cè)鏈，可用于綴合蛋白質(zhì)或其他合適的載體。此路線（圖3）以L-鼠李糖和D-葡萄糖為原料，分別制得單糖受體19、單糖供體20和單糖供體25。前兩者在NIS，AgOTf條件下糖基化得二糖中間體21。二糖中間體21脫保護(hù)成二糖受體22，再次與單糖供體20糖基化得三糖中間體23。三糖中間體23在甲醇鈉條件下脫保護(hù)成糖基受體24。單糖供體25與糖基受體24在NIS、Ag-OTf條件下糖基化，經(jīng)［1＋3］耦合成四糖中間體26。最后，四糖中間體經(jīng)過(guò)連續(xù)甲基化、氫解脫芐基等步驟即得目標(biāo)產(chǎn)物。由于炭疽四糖3上存在2-甲氧基，為了保證高度立體選擇性，線路中使用了2-O位無(wú)鄰基參與的糖基供體進(jìn)行糖基化，但是此反應(yīng)條件極其不易控制，并且降低了產(chǎn)率。1年后，Adamo小組運(yùn)用同一思路，進(jìn)一步合成了糖配體28、29和30（圖4）［13］。這些糖配體的鼠李糖末端均含有與炭疽四糖苷3相同的子結(jié)構(gòu)單元，可通過(guò)不同方式結(jié)合蛋白質(zhì)形成糖綴合物。

圖2 Seeberger的工作

圖3 Kova c的工作

圖4 Ad amo的工作

2.3 基于非糖原料的［1＋3］ 路線 2007年，Guo［14］報(bào)道使用［1＋3］從頭不對(duì)稱合成策略合成炭疽四糖1（圖5）。第一步，先用乙酰呋喃合成重要的吡喃酮中間體8，再由吡喃酮中間體31得到D-單糖中間體32、33和鼠李糖受體34。在鈀催化條件下，鼠李糖受體34上的C-2位羥基與中間體31糖基化結(jié)合成中間體35。中間體35經(jīng)Luche還原羥化后進(jìn)行乙?；Ｗo(hù)，得到鼠李二糖受體36。鼠李二糖受體36如上述流程疊加成鼠李三糖中間體37。鼠李三糖中間體37先經(jīng)還原羥化并?；Ｗo(hù)后得鼠李三糖中間體38。在TMSOTf催化下，鼠李三糖中間體38與單糖中間體32或33結(jié)合成四糖中間體39。最后，四糖中間體經(jīng)甲基化、脫保護(hù)等步驟轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物。總路線共計(jì)25步，總產(chǎn)率為13%。盡管不再使用價(jià)格較貴的鼠李糖和巖藻糖為原料，創(chuàng)新性地選擇了價(jià)格便宜的乙酰呋喃以降低成本，但步驟較繁雜，犧牲了效率。隨后，Guo延續(xù)這一思路進(jìn)一步合成了末端具有疊氮基團(tuán)的炭疽四糖類似物5（圖1）［15］，以便綴合載體蛋白。

2.4 以鼠李糖和半乳糖為原料的［1＋3］路線 同為2007年，Crich［16］課題組報(bào)道采用［1＋3］策略合成了反式糖苷鍵連接athrose末端部分的炭疽四糖2（圖6）。以D-半乳糖和L-鼠李糖為原料分別合成單糖供體44、鼠李糖供體41、鼠李糖受體42和鼠李糖受體40。鼠李糖供體41與鼠李糖受體42在Ph2SO，TTBP，Tf2O，－60℃條件下糖基化結(jié)合后加保護(hù)成二糖中間體43。取二糖中間體43的β-型體與鼠李糖受體40在相同條件下糖基化后脫保護(hù)成鼠李三糖受體45。鼠李三糖受體45與單糖供體44仍采用相同的方式進(jìn)行糖基化結(jié)合，得四糖中間體46。最后選擇β-構(gòu)型四糖中間體46，進(jìn)行相應(yīng)的脫保護(hù)步驟修飾成目標(biāo)產(chǎn)物。此路線使用了較少的基團(tuán)保護(hù)操作，增加了合成的效率，同時(shí)適當(dāng)降低了原料成本。

2.5 以鼠李糖和巖藻糖為原料的［1＋3］路線 2011年，Wang［17］小組報(bào)道采用［1＋3］的策略合成炭疽四糖6（圖7）。此路線以L-鼠李糖和D-巖藻糖為原料，修飾成單糖受體47、單糖中間體48和單糖供體49。將單糖中間體47置于［Ir（COD）（PMePh2）2］PF6條件下異構(gòu)化成相應(yīng)的1-丙烯基的糖基供體，與單糖受體2NIS／TfOH條件下糖基化后經(jīng)堿處理得二糖中間體50。二糖中間體50使用相同方式依次將單糖受體47和單糖受體49糖基化結(jié)合組成四糖中間體52。最后，四糖中間體經(jīng)后續(xù)脫保護(hù)等修飾工作得目標(biāo)產(chǎn)物。路線中所用的兩階段活化烯丙基糖基供體的糖基化方法避免了耗時(shí)的末端基團(tuán)保護(hù)和純化步驟，縮短了反應(yīng)路線。對(duì)于寡糖的合成，不需要任何保護(hù)和脫保護(hù)屬性調(diào)整，顯著簡(jiǎn)化了中間體的制備，并全面提高了合成效率。但原料中的D-巖藻糖價(jià)格較貴，且使用了價(jià)格比較昂貴的促進(jìn)劑，成本較高，不適合實(shí)際投產(chǎn)。

2012年，Grandjean［18］課題組報(bào)道采用［1＋3］策略合成了炭疽四糖類似物8（圖8）。此路線以L-鼠李糖和D-巖藻糖為原料，得到單糖中間體53、單糖受體54、單糖供體55和單糖供體59。單糖受體53與單糖中間體54在NIS，AgOTf催化下糖基化結(jié)合后選擇性脫保護(hù)得二糖受體56。二糖受體56與單糖供體55經(jīng)Schmidt′s糖基化得三糖57。三糖57近一步脫保護(hù)修飾成三糖受體58。三糖受體58與單糖供體59在TMSOTf條件下糖基化耦合得四糖60。最后，四糖60經(jīng)常規(guī)甲基化、氫解脫芐基保護(hù)等步驟得目標(biāo)產(chǎn)物。隨后，Grandjean延續(xù)此思路進(jìn)一步合成了炭疽四糖的環(huán)狀硫酸酯中間體——去甲基化的二糖衍生物9（圖9）。相關(guān)免疫學(xué)活性研究表明，雙糖結(jié)合到牛血清白蛋白（BSA）能夠誘導(dǎo)抗原四糖的IgG抗體反應(yīng)，可以在一個(gè)糖結(jié)合物的抗原制劑中使用［19］。

圖5 Gu o的工作

3 結(jié)論與展望

綜上所述，炭疽四糖的化學(xué)合成已取得了顯著進(jìn)展，同時(shí)也存在諸多不足。這些路線多是使用傳統(tǒng)糖類（碳水化合物）作為前體來(lái)繪制其立體化學(xué)構(gòu)型，如昂貴的D-巖藻糖、D-半乳糖，或不常見(jiàn)的L-鼠李糖。從頭不對(duì)稱合成所使用的原料乙酰呋喃，雖然價(jià)格低廉，但其合成步驟復(fù)雜，效率低。為了節(jié)約步驟，在鼠李寡糖糖基化反應(yīng)中，Kovac、Crich和Wang小組都選擇了無(wú)鄰基參與的α-連接。然而由于沒(méi)有相鄰的基團(tuán)參與，立體選擇性幾乎完全依賴于糖基化條件的確定，目前只有Kovac小組能夠較好地控制反應(yīng)條件。

圖7 Wa n g的工作

圖8 Gr and j ean的工作

圖9 二糖衍生物9

炭疽桿菌的檢測(cè)及新型糖綴合物炭疽疫苗的研發(fā)迫切需要炭疽四糖載體蛋白偶聯(lián)物的大量合成。與蛋白合成相比，糖類合成的難點(diǎn)在于有更多的功能基團(tuán)需要保護(hù)與去保護(hù)，且為了區(qū)分這些相似的官能團(tuán)，保護(hù)和去保護(hù)的方法必須具有很好的選擇性和專一性；更重要的是，糖苷鍵的形成還應(yīng)具有較好的立體選擇性，并且在后續(xù)合成中要保持其構(gòu)型不變，這些因素都是限制多糖合成的主要原因。經(jīng)過(guò)科學(xué)家們不懈的努力，化學(xué)合成寡糖的能力和速度已有較大提高，尤其是一些新型保護(hù)基、新技術(shù)及新策略的出現(xiàn)和應(yīng)用為復(fù)雜寡糖的合成開(kāi)拓了廣闊前景。實(shí)現(xiàn)炭疽四糖的大規(guī)模合成指日可待。由于炭疽四糖及其衍生物結(jié)構(gòu)的極大差異性和復(fù)雜性，各種合成過(guò)程中的分離方法還難以達(dá)到令人滿意的效果。因此，不斷完善有效的炭疽四糖及其衍生物的合成方法仍是當(dāng)前的迫切需求。

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Research progress in the synthesis of antigen Bacillusanthracis tetrasaccharide

HUANG Lei，XU Kehan，WU Junqi，YAO Kuo，YU Shichong，WU Qiuye（Depar tment of Organic Chemist ry，School of Pharmacy，Second M ilitary Me dical Un iversity，S hanghai 200433，China）

ObjectiveAnthrax is an anthropozoonosis caused by the bacterium Bacillusanthracis.Bacillusanthracis is an aerobic，spore-forming，rod-shaped bacterium，which infects human through ingestion or inhalation of the spores.Theexosporium of spores of Bacillusanthracis contains tetrasaccharide antigen w ith specific chemical structure，which can be used in preparation of glycoconjugates vaccines，inducing an immune response.This paper reviewed articles in the last decade that reported research advances in chemical synthesis of anthrax tetrasaccharide，presented themethods for synthesis，and compared the advantages and lim itations among differentmethods.

anthrax tetrasaccharide；glycosylation；chemosynthesis

O621.3；R378.72

A

1006-0111（2015）06-0481-06

10.3969／j.issn.1006-0111.2015.06.001

2014-04-03

］ 2014-07-11［本文編輯］李睿旻

國(guó)家科技重大專項(xiàng)（No.2012ZX09502001-005，2011ZXJ09201-012），國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（No.21202200），第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院大學(xué)生科研訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目

黃 蕾，碩士研究生.Tel：13062669850；E-mail：huanglei0026＠163.com

吳秋業(yè)，教授.研究方向：抗真菌、抗腫瘤藥物、寡糖及其他天然產(chǎn)物的全合成研究.Tel：（021）81871225；E-mail：qyw u2008＠163.com