姜麗，王燕

(煙臺(tái)海港醫(yī)院，山東煙臺(tái)264000)

有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-99b(miR-99b)在人乳頭瘤狀病毒(HPV)陽性的宮頸腺癌組織中低表達(dá)［1～4］，但miR-99b在宮頸癌惡性轉(zhuǎn)化中的作用尚不清楚。本研究探討上調(diào)miR-99b表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲及化療敏感性的影響，為宮頸癌的藥物治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌組織及癌旁組織標(biāo)本取自2013年9月～2014年9月本院住院治療的24例宮頸癌患者，年齡(54.27±4.62)歲，病歷及隨訪資料詳實(shí)完整，為原發(fā)性宮頸癌，無其他合并癥，病理診斷為腺癌或鱗癌，所有患者均簽署知情同意書。取上述患者的癌旁或鱗癌的遠(yuǎn)端上皮組織，并經(jīng)病理檢查證實(shí)無癌細(xì)胞浸潤(rùn)，作為對(duì)照。宮頸癌細(xì)胞(HPV-18陽性 HeLa細(xì)胞系、C4-1細(xì)胞系，HPV-16陽性CaSki細(xì)胞系、SiHa細(xì)胞系)均購于北京中原公司。順鉑、卡鉑購自齊魯制藥公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將HeLa細(xì)胞、C4-1細(xì)胞、CaSki細(xì)胞、SiHa細(xì)胞用含10%Gibco胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，內(nèi)含雙抗(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)。當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時(shí)，用0.25%胰酶消化，進(jìn)行傳代，并置于37℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞鋪于6孔板或96孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)70%，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用LipofectamineTM2000(購自 Invitrogen公司)試劑分別將miR-99b、陰性對(duì)照Scramble(均購自廣州銳博公司)轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞、C4-1細(xì)胞、CaSKi細(xì)胞、SiHa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 miRNA的提取、擴(kuò)增及檢測(cè) 用miRNA快速提取試劑盒(購買自北京天根公司)提取宮頸癌組織、癌旁組織、正常宮頸上皮組織及Hela細(xì)胞、C4-1細(xì)胞、CaSKi細(xì)胞、SiHa細(xì)胞中miRNA，提取得到的總RNA樣本于-80℃存儲(chǔ)。取2 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自北京天根公司)進(jìn)行擴(kuò)增，DEPC水5.3 μL，RT-PCR緩沖液 2 μL，上下游引物(購自銳博公司)各0.1 μL，RNA 酶抑制劑 0.1 μL，混合酶 0.4 μL，底物1 μL。42℃ 60 min，70 ℃ 5 min，-20 ℃保存。使用 SYBR Real-time PCR detection kit熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(購自北京天根公司)對(duì)miR-99b的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 細(xì)胞增殖測(cè)定 采用CCK-8法。在96孔板中接種濃度為1×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液(100 μL/孔)。將培養(yǎng)板放培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)。于培養(yǎng)12、24、36、48 h，向每孔中加入10 μL的CCK-8溶液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)450 nm處的吸光度(OD)值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖活力。

1.5 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell法。使用24孔BD基質(zhì)膠侵襲小室(購自BD Biosciences公司)進(jìn)行細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)。將每組轉(zhuǎn)染不同片段細(xì)胞用胰酶消化后，使用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸。將200 μL細(xì)胞懸液加入上室，下室則加入800 μL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，使用濕棉簽拭去小室膜上未侵襲的細(xì)胞，底部細(xì)胞用3%多聚甲醛固定，并用0.1%結(jié)晶紫進(jìn)行染色，33%乙酸萃取，使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)。以空白對(duì)照組測(cè)得的OD值為1，轉(zhuǎn)染Scramble組和轉(zhuǎn)染miR-99b組的侵襲能力為兩組的OD值與空白對(duì)照組OD值之比。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞半數(shù)有效抑制濃度(IC50)測(cè)定 采用CCK-8法。取miRNA轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞，加入順鉑或卡鉑處理細(xì)胞(對(duì)每一組細(xì)胞，控制順鉑的最終濃度分別為:1、2 、3 、4 、5 、6 、7 、8 、9 、10 μg/mL;卡鉑的最終濃度分別為:0.1 、0.2 、0.3 、0.4 、0.5 、0.6 、0.7 、0.8 、0.9 、1.0 μg/mL)，加入藥品后48 h，向相應(yīng)孔中加入10 μL的 CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的OD值，并使用Origin8.5.1軟件計(jì)算IC50。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS9.2統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-99b在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平比較

宮頸癌HeLa細(xì)胞系、C4-1細(xì)胞系、CaSki細(xì)胞系、SiHa細(xì)胞系中miR-99b的表達(dá)水平分別為0.64±0.08、0.31 ±0.06、0.45 ±0.07、0.23 ±0.04，均低于正常宮頸上皮組織(1.00±0.00)(P均＜0.05)，C4-1細(xì)胞系和SiHa細(xì)胞系中miR-99b的表達(dá)水平較HeLa細(xì)胞系和CaSki細(xì)胞系更低。

2.2 miRNA-99b對(duì)宮頸癌細(xì)胞株增殖活力的影響見表1。

2.3 miR-99b對(duì)宮頸癌細(xì)胞株侵襲能力的影響見表2。

2.4 miR-99b對(duì)宮頸癌細(xì)胞株化療敏感性的影響見表3。

表1 轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞株的增殖活力比較(±s)

表1 轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞株的增殖活力比較(±s)

注:與同種細(xì)胞空白對(duì)照組、轉(zhuǎn)染Scramble組比較，*P＜0.05。

細(xì)胞增殖活力0 h 12 h 24 h 36 h 48 h Hela 細(xì)胞空白對(duì)照組 1±0.00 2.2±0.21 3.6±0.34 5.1±0.55 8.7±0.83轉(zhuǎn)染Scramble組 1±0.00 1.8±0.16 3.1±0.29 5.8±0.59 9.1±0.97轉(zhuǎn)染miR-99b組 1±0.00 1.7±0.19 3.4±0.36 4.1±0.46 6.1±0.66*C4-1細(xì)胞空白對(duì)照組 1±0.00 2.2±0.24 2.6±0.28 4.1±0.41 6.2±0.56轉(zhuǎn)染Scramble組 1±0.00 1.9±0.18 3.0±0.31 3.8±0.39 5.8±0.62轉(zhuǎn)染miR-99b組 1±0.00 1.8±0.20 2.4±0.25 3.1±0.30 4.1±0.39*CaSKi細(xì)胞空白對(duì)照組 1±0.00 1.7±0.16 2.7±0.29 3.7±0.33 5.7±0.52轉(zhuǎn)染Scramble組 1±0.00 1.9±0.18 2.9±0.30 3.8±0.39 4.8±0.51轉(zhuǎn)染miR-99b組 1±0.00 1.5±0.14 2.4±0.23 3.1±0.29 3.3±0.33*SiHa細(xì)胞空白對(duì)照組 1±0.00 2.2±0.23 3.5±0.37 5.0±0.52 7.5±0.77轉(zhuǎn)染Scramble組 1±0.00 1.9±0.20 3.1±0.33 5.5±0.57 7.2±0.74轉(zhuǎn)染miR-99b組 1±0.00 1.7±0.19 3.4±0.31 4.1±0.44 5.1±0.53*

表2 轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞株的侵襲能力比較(±s)

表2 轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞株的侵襲能力比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別細(xì)胞空白對(duì)照組侵襲能力Hela細(xì)胞 C4-1細(xì)胞 CaSKi細(xì)胞 SiHa 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00轉(zhuǎn)染Scramble組 0.92±0.15 1.07±0.18 1.18±0.31 0.89±0.21轉(zhuǎn)染miR-99b組 0.41±0.10*0.37±0.12*0.51±0.21*0.46±0.15*

3 討論

宮頸癌主要分為鱗癌和腺癌兩種［5］。在宮頸上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的過程中，高危型HPV發(fā)揮重要作用，HPV-16、HPV-18 與宮頸腺癌密切相關(guān)［6］，但宮頸癌發(fā)生的具體分子機(jī)制尚不清楚。目前，化療是治療宮頸癌的重要手段，以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療結(jié)合放療是治療晚期宮頸癌的主要方法［7］。但隨著化療時(shí)間的延長(zhǎng)，腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)鉑類化療藥物逐漸產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致宮頸癌治療失?。?］。因此，如何提高宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性是治療的關(guān)鍵［9］。

miRNA是生物體中存在的重要的基因調(diào)控因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］。不同化療藥物對(duì)miRNA的表達(dá)會(huì)有影響，并且許多miRNA與腫瘤細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性也密切相關(guān)。Turcatel等［11］發(fā)現(xiàn)在正常小鼠乳腺細(xì)胞中，miR-99a和miR-99b能夠調(diào)節(jié)TGF-β誘導(dǎo)的乳腺上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化;Kang等［12］研究表明，在非小細(xì)胞肺癌中，miR-99b通過直接調(diào)控靶基因成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用;miR-99b還可通過調(diào)控mTOR信號(hào)通路增強(qiáng)放療敏感性［13］。然而，目前miR-99b對(duì)宮頸癌細(xì)胞化療敏感性影響的報(bào)道不多，其發(fā)揮功能的具體分子生物學(xué)機(jī)制仍不清楚。

表3 轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞株對(duì)抗腫瘤藥物的IC50值比較(μg/mL，±s)

表3 轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞株對(duì)抗腫瘤藥物的IC50值比較(μg/mL，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，*P ＜0.05，#P ＜0.01。

IC50組別 順鉑 卡鉑空白對(duì)照組Hela細(xì)胞 3.18±0.35 0.69±0.08 C4-1細(xì)胞 4.15±0.28 0.76±0.09 CaSKi細(xì)胞 2.18±0.35 0.39±0.07 SiHa細(xì)胞 5.18±0.65 0.57±0.06轉(zhuǎn)染Scramble組Hela細(xì)胞 3.56±0.41 0.64±0.07 C4-1細(xì)胞 3.82±0.18 0.69±0.07 CaSKi細(xì)胞 2.56±0.31 0.44±0.05 SiHa細(xì)胞 5.36±0.51 0.52±0.07轉(zhuǎn)染miR-99b組Hela細(xì)胞 2.35±0.31* 0.31±0.02#C4-1細(xì)胞 2.44±0.11# 0.41±0.04*CaSKi細(xì)胞 0.75±0.21# 0.21±0.03*SiHa細(xì)胞 2.75±0.41# 0.21±0.02#

在本研究中，使用熒光定量PCR法對(duì)宮頸癌四種細(xì)胞系中miR-99b的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-99b在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)均低于正常宮頸上皮組織，這提示miR-99b在宮頸癌組織中的低表達(dá)可能具有某種生物學(xué)意義。用miR-99b Mimics轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系，成功構(gòu)建了miR-99b的過表達(dá)體系。CCK-8檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染Scramble組相比，miR-99b過表達(dá)組中四種宮頸癌細(xì)胞系的增殖能力均受到了明顯的抑制，這表明miR-99b具有抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的作用。同樣，Transwell檢測(cè)結(jié)果則顯示與Scramble組相比，miR-99b過表達(dá)組中四種宮頸癌細(xì)胞系的侵襲能力明顯下降，這表明miR-99b具有抑制宮頸癌細(xì)胞侵襲的能力。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，與Scramble組相比，miR-99b過表達(dá)組中IC50數(shù)值均明顯降低，細(xì)胞對(duì)順鉑、卡鉑的敏感性明顯增強(qiáng)，這表明miR-99b能夠改善宮頸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性。

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