湯喻，史祖宣

(河南省人民醫(yī)院，鄭州450003)

人工合成的胰島素及類似物臨床廣泛用于2型糖尿病的治療，通過激活胰島素受體(IR)、胰島素生長因子受體1(IGF-1R)及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(Akt)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和促有絲分裂作用。有研究發(fā)現(xiàn)，IR、IGF-1R及MAPK、PI3K/Akt信號通路的異?？赡茉谀承┠[瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［1］;而不同的胰島素及類似物對乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞可產(chǎn)生促進(jìn)或抑制增殖的作用［2，3］，但其在乳腺癌細(xì)胞增殖中的作用研究較少。2010～2014年我們比較了甘精胰島素和地特胰島素對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購于中科院上海生科院細(xì)胞庫。甘精胰島素由賽諾菲(北京)制藥有限公司提供，地特胰島素由諾和諾德(中國)制藥有限公司提供。MTT試劑盒、碘化丙啶(PI)、MAPKK1抑制劑PD98059、PI3K抑制劑LY294002、Akt、磷酸化 Akt(p-Akt)(ser473)、Erk1/2、磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存細(xì)胞1支，迅速置于37℃水浴中，并輕輕搖動令其內(nèi)容盡快融化。待細(xì)胞懸液融化，消毒管口，超凈臺內(nèi)打開凍存管蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液移至離心管中，補加1 mL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸浮。室溫，1 500 r/min，離心 3 min，棄上清，重新加入 1 mL含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，吹打重懸細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶中，補足含10%FBS的 RPMI 1640培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中松蓋培養(yǎng)。次日換液1次，以后根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)1～3 d換液。吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入1～2 mL 0.25%的胰蛋白酶液靜置3～5 min，加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。吸取少許細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，加適量含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液于接種了細(xì)胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日換液1次，以后根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)1～3 d換液。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3 細(xì)胞增殖檢測 采用MTT法。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以3×103個/孔接種于96孔板，并貼壁培養(yǎng)24 h。行以下處理:①1 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用24、48、72、96 h;②10、100、1 000 U/L 甘精胰島素或地特胰島素作用48 h;③1 U/L甘精胰島素 +20 μmol/L PD98059、1 U/L 甘精胰島素 +10 μmol/L LY2904002作用48 h。以上均設(shè)正常對照組。每孔加入MTT液10 μL，培養(yǎng)4 h。吸棄孔內(nèi)液體，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μL，震蕩搖勻10 min，酶標(biāo)儀于490 nm處測各孔吸光度值(OD值)計算細(xì)胞增殖活力。

1.4 細(xì)胞周期檢測 采用流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞以8×104個/孔接種于6孔板，并貼壁培養(yǎng)48 h，10 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用24 h，設(shè)立正常對照組。收集細(xì)胞，PBS洗2次，離心后的細(xì)胞沉淀用300 μL PBS重懸，逐滴加入700 μL無水乙醇，4℃避光過夜。PBS洗2次，PI染液染色，4℃避光30 min，流式細(xì)胞儀測細(xì)胞周期。

1.5 Erk1/2、Akt磷酸化程度檢測 采用Western blotting法。細(xì)胞以8×104個/孔接種于6孔板，貼壁48 h，10 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用24 h，設(shè)立正常對照組。提取蛋白，BCA法測蛋白濃度，蛋白濃度調(diào)至4.0 μg/μL，5 ×上樣緩沖液混合，沸水煮10 min，冷卻后25 μL上樣，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉2 h，一抗搖床4℃孵育過夜，洗膜3次后二抗孵育1 h。洗膜3次后DAB顯色。采用VisionWorkLS軟件分析磷酸化程度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組定量資料比較用單因素方差分析或Kruskal-Wallis秩和檢驗，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同作用時間甘精胰島素、地特胰島素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響 1 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用24 h均未引起MCF-7細(xì)胞增殖;1 U/L甘精胰島素作用48、72、96 h均引起MCF-7細(xì)胞增殖，呈時間依賴關(guān)系(P＜0.05);地特胰島素增殖作用不明顯。見表1。

表1 1 U/L甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細(xì)胞24、48、72、96 h增殖水平比較(±s)

表1 1 U/L甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細(xì)胞24、48、72、96 h增殖水平比較(±s)

注:與對照組同時點比較，*P＜0.05;與地特胰島素組同時點比較，#P＜0.05;與同組96 h比較，△P＜0.05。

組別細(xì)胞增殖活力24 h 48 h 72 h 96 h對照組 0.233 4±0.011 4 0.237 3±0.010 5 0.301 7±0.014 50.315 5±0.022 0地特胰島素組 0.217 2±0.010 5 0.251 1±0.010 2 0.309 3±0.014 7 0.347 3±0.039 9甘精胰島素組 0.222 8±0.010 6 0.302 9±0.012 9*#△ 0.372 2±0.015 1*#△ 0.456 7±0.025 1*#

2.2 不同濃度甘精胰島素或地特胰島素對MCF-7細(xì)胞增殖的影響 培養(yǎng)48 h后，甘精胰島素10、100、1 000 U/L均引起MCF-7細(xì)胞增殖，呈濃度依賴關(guān)系(P＜0.05);地特胰島素則增殖作用不明顯。見表2。

表2 不同濃度甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細(xì)胞48 h 增殖水平比較(±s)

表2 不同濃度甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細(xì)胞48 h 增殖水平比較(±s)

注:與對照組同濃度比較，*P＜0.05;與地特胰島素組同濃度比較，#P＜0.05;與同組1 000 U/L比較，△P＜0.05。

組別胰島素細(xì)胞增殖活力10 U/L胰島素 100 U/L胰島素 1 000 U/L對照組0.195 7±0.006 5 0.195 7±0.006 5 0.195 7±0.006 5地特胰島素組 0.206 6±0.007 6 0.215 7±0.007 6 0.226 2±0.007 3甘精胰島素組 0.259 2±0.007 2*#△0.267 2±0.006 9*#△0.300 7±0.017 9*#

2.3 10 U/L甘精胰島素或地特胰島素作用MCF-7細(xì)胞24 h細(xì)胞周期變化 對照組S+G2/M期細(xì)胞(27.316 7±5.597 7)%、地特胰島素組S+G2/M期細(xì)胞(30.036 7±2.707 1)%、甘精胰島素組S+G2/M期細(xì)胞(37.996 7±6.278 1)，甘精胰島素組反映增殖活性的S+G2/M期細(xì)胞明顯高于對照組(P＜0.05)，而地特胰島素對細(xì)胞增殖作用不明顯。

2.4 10 U/L甘精胰島素、地特胰島素作用MCF-7細(xì)胞24 h Erk1/2和Akt磷酸化程度 對照組Erk、Akt磷酸化程度分別為(44.41±5.97)%、(47.78±1.09)%，地特胰島素組分別為(54.27±10.06)%、(51.63±2.02)%，甘精胰島素組分別為(66.07±5.20)%、(56.53±4.37)%。甘精胰島素組MCF-7細(xì)胞Erk1/2、Akt磷酸化程度較對照組升高(P均＜0.05)，而地特胰島素組升高不明顯。

2.5 1 U/L甘精胰島素聯(lián)合抑制劑作用MCF-7細(xì)胞48 h細(xì)胞生長情況 MCF-7細(xì)胞中，1 U/L甘精胰島素+PD98059、1 U/L甘精胰島素 +LY294002作用MCF-7細(xì)胞48 h，其細(xì)胞OD值分別為0.175 0±0.002 3、0.192 0 ±0.001 6，明顯少于甘精胰島素組、對照組(0.242 4±0.007 7、0.203 4±0.003 8，P均＜0.05)，但甘精胰島素+PD98059組細(xì)胞數(shù)目減少更明顯(P＜0.05)。

3 討論

MAPK和PI3K/Akt/mTOR信號通路是人體內(nèi)重要的信號通路，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤血管形成，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腫瘤侵襲性，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用［4，5］。2型糖尿病患者肝癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等腫瘤發(fā)病風(fēng)險增高［6］，主要與 IR、IGF-1R 及下游 MAPK、PI3K/Akt信號通路的激活有關(guān)［1］。2型糖尿病導(dǎo)致胰島素抵抗和高胰島素血癥，高胰島素水平減少胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-2，使游離的有生物活性的IGF-1增多［7］。胰島素、IGF-1激活I(lǐng)R、IGF-1R。IR和IGF-1R有極其相近的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［8］，即MAPK、PI3K/Akt信號通路，共同在高胰島素血癥下的惡性細(xì)胞增殖中發(fā)揮作用。近年來，大量研究報道2型糖尿病治療藥物二甲雙胍［9］、胰島素及類似物［2，3］、噻唑烷二酮類［10］、磺脲類［11］等可通過調(diào)節(jié)MAPK和(或)PI3K/Akt信號通路影響腫瘤細(xì)胞生長。2型糖尿病治療藥物與腫瘤風(fēng)險的關(guān)系引起了高度關(guān)注。

甘精胰島素是在人胰島素B鏈C端增加2個精氨酸并用甘氨酸取代A鏈21位門冬氨酸后得到的胰島素類似物;地特胰島素是去除人胰島素B鏈30位蘇氨酸，并在B鏈29位賴氨酸上增加一個肉豆蔻酸側(cè)鏈得到的胰島素類似物。二者分子結(jié)構(gòu)的不同，決定了它們對于IR、IGF-1R的親和力不同。Kurtzhals等［12］研究認(rèn)為地特胰島素與IR的親和力比人胰島素稍低;地特胰島素與IGF-1R的親和力比人胰島素降低5倍，甘精胰島素與IGF-1R的親和力是人胰島素的6.5倍。因此不同的胰島素及類似物對腫瘤細(xì)胞生長的影響可能不同。經(jīng)過大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查后，Hemkens等［13］報道，相同用量下甘精胰島素導(dǎo)致腫瘤的風(fēng)險高于人胰島素。Dejgaard等［14］報道2型糖尿病患者使用地特胰島素患腫瘤的風(fēng)險比使用魚精蛋白鋅胰島素或甘精胰島素者降低或相當(dāng)。而乳腺癌細(xì)胞的體外實驗發(fā)現(xiàn)，甘精胰島素和地特胰島素對乳腺癌細(xì)胞株MCF-7有明顯地促進(jìn)增殖作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，甘精胰島素對MCF-7細(xì)胞促增殖作用明顯，地特胰島素對細(xì)胞促增殖作用不明顯，兩藥差異有統(tǒng)計意義。二者對MCF-7細(xì)胞增殖作用的差異可能是因為兩藥對IR、IGF-1R的親和力不同。兩藥以1 U/L作用MCF-7細(xì)胞24 h，均未引起細(xì)胞增殖，但甘精胰島素以1 U/L作用48 h可以引起細(xì)胞增殖，甘精胰島素10 U/L作用24 h S+G2/M期細(xì)胞增多，證實甘精胰島素對MCF-7細(xì)胞增殖作用呈濃度、時間依賴關(guān)系。兩藥10 U/L作用24 h Erk1/2和Akt磷酸化程度增高，而地特胰島素組與對照組比較差異無統(tǒng)計意義，說明在甘精胰島素引起細(xì)胞增殖過程中，MAPK、PI3K/Akt通路均被激活。使用抑制劑后MCF-7細(xì)胞數(shù)目減少，但Erk1/2被阻斷后細(xì)胞數(shù)目減少更明顯，說明MAPK通路在甘精胰島素引起MCF-7細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮更為重要的作用。

綜上所述，甘精胰島素對乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖作用明顯，而地特胰島素增殖作用不明顯，其機(jī)制可能為二者對IR、IGF-1R親和力不同。在甘精胰島素促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖的過程中，MAPK和PI3K/Akt通路均被激活，但MAPK通路更重要。

［1］Vigneri P，F(xiàn)rasca F，Sciacca L，et al.Diabetes and cancer［J］.Endocr Relat Cancer，2009，16(4):1103-1123.

［2］Shukla A，Grisouard J，Ehemann V，et al.Analysis of signaling pathways related to cell proliferation stimulated by insulin analogs in human mammary epithelial cell lines［J］.Endocr Relat Cancer，2009，16(2):429-441.

［3］Yehezkel E，Weinstein D，Simon M.Long-acting insulin analogues elicit atypical signalling events mediated by the insulin receptor and insulin-like growth factor-I receptor［J］.Diabetologia，2010，53(12):2667-2675.

［4］Shen Q，Uray IP，Li Y，et al.The Ap-1 transcription factor regulates breast Cancer cell growth via cyclins and E2F factors［J］.Oncogene，2008，27(3):366-377.

［5］Park CM，Park MJ，Kwak HJ，et al.Ionizing radiation enhances matrix metallo Proteinase-2 Secretion and invasion of glioma cells through src/epidermal growth factor receptor mediated P38/Akt and Phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathways［J］.Cancer Res，2006，66(17):8511-8519.

［6］Atchison EA，Gridley G，Carreon JD，et al.Risk of cancer in a large cohort of U.S.veterans with diabetes［J］.Int J Cancer，2011，28(3):635-643.

［7］Kaaks R，Lukanova A.Energy balance and cancer:the role of insulin and insulin-like growth factor-1［J］.Proc Nutr Soc，2001，60(1):91-106.

［8］Smith U，Gale EA.Does diabetes therapy influence the risk of cancer［J］.Diabetologia，2009，52(9):1699-1708.

［9］Alimova IN，Liu B，F(xiàn)an Z，et al.Metformin inhibits breast cancer cell growth，colony formation and induces cell cycle arrest in vitro［J］.Cell Cycle，2009，8(6):909-915.

［10］He G，Sung YM，Digiovanni J，et al.Thiazolidinediones inhibit insulin-like growth factor-1 induced activation of p70S6 kinase and suppress insulin-like growth factor-1 tumor-promoting activity［J］.Cancer Res，2006，66(3):1873-1878.

［11］Ma P，Gu B，Ma J，et al.Glimepiride induces proliferation and differentiation of rat osteoblasts via the PI3-kinase/Akt pathway［J］.Metabolism，2010，59(3):359-366.

［12］Kurtzhals P，Kristensen C，Jonassen I，et al.Correlations of receptor binding and metabolic and mitogenic potencies of insulin analogs designed for clinical use［J］.Diabetes，2000，49(6):999-1005.

［13］Hemkens LG，Grouven U，Bender R，et al.Risk of malignancies in patients with diabetes treated with human insulin or insulin analogues:a cohort study［J］.Diabetologia，2009，52(9):1732-1744.

［14］Dejgaard A，Lynggaard H，R?stam J，et al.No evidence of increased risk of malignancies in patients with diabetes treated with insulin detemir:a meta-analysis［J］.Diabetologia，2009，52(12):2507-2512.