杜藝，錢(qián)白音，魏玉婷，李素霞，李宓

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東珠海519000)

鹽酸曲美他嗪(TMZ)在心肌缺血時(shí)能抑制脂肪酸的β氧化、促進(jìn)葡萄糖氧化利用，改善心肌細(xì)胞能量代謝［1］，目前廣泛用于缺血性心臟病的治療。研究發(fā)現(xiàn)，腎臟和心肌缺血再灌注損傷(IRI)均存在三磷酸腺苷產(chǎn)生不足、氧自由基大量產(chǎn)生、胞內(nèi)鈣超載等機(jī)制［2～4］;TMZ可通過(guò)上述途徑對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用，但其在腎臟IRI時(shí)是否具有相同的保護(hù)作用報(bào)道較少。2012～2014年我們觀察了TMZ對(duì)大鼠腎臟IRI的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠90只(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，15周齡，體質(zhì)量(236±10)g;TMZ(法國(guó)施維雅藥廠)，血清尿素氮(BUN)、肌酐(SCr)、IL-18、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，721分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 動(dòng)物分組與模型制作 隨機(jī)將大鼠分為A、B兩組各45只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，溫度約為23℃，濕度60%，12 h交替照明，自由飲水、飲食。第3天，A組給予生理鹽水稀釋的TMZ 10 mg/(kg·d)灌胃5 d，再隨機(jī)分為缺血再灌注(IR1)組、缺血再灌注后處理(IPO1)組、假手術(shù)(S1)組，每組15只。B組大鼠生理鹽水灌胃，生理鹽水用法、用量同TMZ，再隨機(jī)分為缺血再灌注(IR2)組、缺血再灌注后處理(IPO2)組、假手術(shù)(S2)組，每組15只。參考Basile等［5］的方法制備缺血再灌注的急性腎損傷動(dòng)物模型。缺血再灌注后處理(IPO):在缺血45 min后用血管夾同時(shí)給予雙側(cè)腎臟恢復(fù)血供20 s、阻斷血供20 s處理，反復(fù)10次后恢復(fù)血供。假手術(shù)組:手術(shù)方法同上，但僅分離出大鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈，不進(jìn)行夾閉。手術(shù)后肉眼觀察腎臟恢復(fù)灌注，除在0 h時(shí)取標(biāo)本組沒(méi)有縫合腹腔，剩余大鼠均逐層縫合腹腔。各組缺血過(guò)程保持大鼠肛溫在36.5～37.0℃。

1.3 血清BUN、SCr、NGAL、IL-18水平檢測(cè) 分別在末次恢復(fù)腎臟血供0、6、12、24、48 h，取 A、B 組缺血再灌注、IPO大鼠各3只分別經(jīng)眶后靜脈叢采集靜脈血2～3 mL，離心(3 000 r/min)15 min，取血清于-20℃保存，待測(cè)SCr、BUN?；瘜W(xué)比色法檢測(cè)血BUN、SCr;應(yīng)用ELISA法測(cè)定NGAL、IL-18。并在末次恢復(fù)腎臟血供0 h取假手術(shù)組大鼠血清檢測(cè)BUN、SCr、NGAL、IL-18。

1.4 腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察 在各時(shí)間點(diǎn)取血清標(biāo)本后脊椎脫臼法處死大鼠，開(kāi)腹，迅速摘除腎臟，用冰浴生理鹽水沖洗后，經(jīng)腎門(mén)處橫斷面切一片厚度為2～3 mm的組織片，用100 mL/L甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片后，行HE和PAS染色。光鏡下觀察形態(tài)，參考Paller等［6］的方法進(jìn)行評(píng)分，隨機(jī)選擇10個(gè)無(wú)重疊視野(×200)，每個(gè)視野下隨機(jī)選擇10處腎小管，共100處腎小管計(jì)分，分?jǐn)?shù)越高表示腎小管損傷程度越嚴(yán)重。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間血BUN、SCr、NGAL、IL-18水平及腎小管損傷程度評(píng)分比較 見(jiàn)表1。

2.2 各組腎形態(tài)學(xué)變化 S1、S2組腎小球和腎小管未發(fā)現(xiàn)明顯異常;IR1、IR2組腎小管上皮細(xì)胞混濁腫脹、空泡變性，腎小管明顯擴(kuò)張，上皮細(xì)胞發(fā)生變性、壞死，間質(zhì)充血水腫，基底膜斷裂;IPO1、IPO2組腎小球囊腔增寬，只見(jiàn)部分腎小管有輕度腫脹、變性，腎小管擴(kuò)張及壞死程度均減輕。

3 討論

急性腎臟IRI多見(jiàn)于低血容量性休克、急性腎動(dòng)脈阻斷以及腎臟移植、腎擠壓傷、體外震波碎石等情況，可以造成急性腎損傷或使移植腎功能延遲恢復(fù)。此外，它也是腎水平以上主動(dòng)脈手術(shù)和急性腎衰的一種常見(jiàn)而又可危及患者生命的并發(fā)癥。因此，如何有效防止因急性腎臟IRI而導(dǎo)致的各種急慢性腎臟疾病是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題［7］。在腎臟IRI的防治中，丙泊酚、P選擇素單克隆抗體、N-去硫酸肝素等雖有報(bào)道［8］，但并未得到廣泛認(rèn)可和應(yīng)用，急性腎臟IRI早期藥物治療一直在探索之中，但現(xiàn)階段主要治療手段仍是腎臟替代治療，尤其是持續(xù)腎臟替代治療。

TMZ是第一個(gè)長(zhǎng)鏈3-酮?；o酶A硫解酶抑制劑。研究表明，它不僅能通過(guò)增強(qiáng)葡萄糖氧化代謝、恢復(fù)糖酵解和碳水化合物之間的偶聯(lián)，在耗氧較少的情況下產(chǎn)生三磷酸腺苷，同時(shí)還可以減輕心肌細(xì)胞內(nèi)酸中毒和高鈣血癥、限制炎癥反應(yīng)以及減少氧自由基生成等抗IRI，并能降低心臟交感神經(jīng)活性，目前已廣泛應(yīng)用于缺血性心臟病的治療［9～11］。

IPO是臨床治療IRI的重要手段，如在冠心病的治療、器官移植中的運(yùn)用［12］。急性腎IPO對(duì)IRI的保護(hù)作用已經(jīng)得到公認(rèn)，本實(shí)驗(yàn)與急性腎IPO對(duì)腎臟的保護(hù)作用做對(duì)比，進(jìn)一步觀察TMZ的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，IR1組與IPO1組比較，各時(shí)間點(diǎn)各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;IR1組與IR2組比較，在6 h時(shí)IR2組的NGAL、IL-18、腎小管損傷程度評(píng)分明顯上升;12 h時(shí)BUN開(kāi)始明顯上升，24 h時(shí)IR2組的各項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于IR1組，48 h時(shí)BUN、SCr仍顯著高于IR1組。IPO1組與IPO2組比較，在6 h時(shí)IPO2組的NGAL明顯上升，12 h時(shí)除SCr外均有上升，24 h時(shí)除NGAL外其他指標(biāo)均高于IPO1組，48 h時(shí)BUN、SCr、腎小管損傷程度評(píng)分仍顯著高于IPO1組。說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)前使用SMZ可以減輕腎IRI的程度。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，IR1組與IPO2組比較，在6 h時(shí)IPO2組NGAL明顯上升，12 h時(shí)除SCr外其他指標(biāo)均顯著高于IR1組，48 h時(shí)SCr仍顯著高于IR1組。提示實(shí)驗(yàn)前使用SMZ可獲得與缺血后處理相似的效果。綜上所述，在IRI發(fā)生前即預(yù)防性使用TMZ可以減輕腎功能損傷。

表1 各組不同時(shí)間血清BUN、SCr、NGAL、IL-18水平及腎小管損傷程度評(píng)分比較(±s)

表1 各組不同時(shí)間血清BUN、SCr、NGAL、IL-18水平及腎小管損傷程度評(píng)分比較(±s)

注:與同組中S1組或S2組比較，*P＜0.05;與IR2組同時(shí)間點(diǎn)比較，#P＜0.05;與IPO2組同時(shí)間點(diǎn)比較，△P＜0.05;與IPO2組同時(shí)間點(diǎn)比較，▽P＜0.05。

組別 BUN(mmol/L) SCr(μmol/L) NGAL(pg/mL) IL-18(pg/mL) 腎小管損傷程度評(píng)分(分A 組IR1組0 h 12.03±3.33 27.81±5.78 67.14± 9.96 489.13±22.03 33±11 6 h 17.56±6.11* 28.01±3.79 160.98±11.34*#▽ 580.23±23.63*#▽ 58±16*#12 h 27.11±2.01*#▽ 26.43±5.23 246.88±20.05*#▽ 828.53±39.01*#▽ 150±36*#▽24 h 30.71±1.93*# 29.55±4.07#▽ 128.42±19.73*#▽ 724.33±17.88*#▽ 322±32*#▽48 h 12.54±1.91#▽ 24.83±6.51#△▽ 70.05± 9.34 490.43±17.56 390±22*IPO1組0 h 12.89±2.56 27.88±5.06 67.14± 9.99 508.89±22.87 32±12 6 h 18.44±6.01* 28.16±3.33 120.27±10.55＊△ 602.23±17.32* 50±14*12 h 20.21±2.04＊△ 28.67±4.99 239.57±19.88＊△ 783.28±19.77＊△ 111±23＊△24 h 21.44±1.63＊△ 28.98±3.33△ 144.32±16.78* 553.23±16.53＊△ 342±19＊△48 h 11.34±1.67#△ 27.53±5.67#△ 82.34± 8.23 550.21±15.54 300±12＊△S1組 12.09±2.03 25.31±4.74 65.09±10.56 487.04±21.09 33±12 B組IR2組0 h 13.39±2.34 27.31±5.61 68.79± 9.67 489.54±23.88 30±10 6 h 17.74±6.17* 28.87±3.83 226.78±11.53* 639.23±23.63* 72±16*12 h 40.18±3.21* 28.24±6.03 384.76±28.93* 1113.54±27.71* 222±12*24 h 41.55±1.88* 50.66±3.77* 285.47±16.34* 932.56±19.99* 553±32*48 h 22.54±1.93* 45.36±6.51* 80.05± 9.66 513.37±16.85 408±27*IPO2組0 h 13.87±3.01 27.54±4.98 69.19±11.23 473.34±22.88 29±13 6 h 18.31±5.02* 28.34±4.07 180.23± 7.99* 627.08±14.37* 50±12*12 h 32.17±3.33* 26.13±6.84 309.73±26.54* 913.01±25.55* 220±21*24 h 29.53±1.80* 43.77±3.01* 174.93±15.22* 799.51±23.22* 423±27*48 h 19.54±1.91* 38.36±5.53* 79.05±13.01 522.83±16.37 380±32*S2組 11.69±2.15 27.34±5.69 67.98±12.37 458.15±20.77 29±10

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