孫厚良，李晶，龍明，封玉玲

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W校，重慶萬州404120)

目前研究認為，大麻受體有兩種:Ⅰ型大麻受體(CB1)和Ⅱ型大麻受體(CB2)［1］。早在1993年Munro等即從淋巴組織中發(fā)現(xiàn)了CB2，之后在小腦、大腦皮層和腦干中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)［2］，CB2廣泛存在于中樞和外周組織。CB2有典型的G蛋白偶聯(lián)受體七次跨膜結構域，能與花生四烯酸乙醇胺、△9-四氫大麻酚等配體結合產(chǎn)生對應作用［1］，通過激活多重細胞內信號轉導通路，包括通過抑制腺苷酸環(huán)化酶、抑制鈣通道、激活鉀通道和MAP激酶通道等來抑制環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的生成，還可以調節(jié)磷酯酰肌醇-3-激酶和神經(jīng)酰胺的代謝，來發(fā)揮免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用［3］。為了進一步探討人CB2(hCB2)在生物體內發(fā)揮作用的機制，于2014年4～10月我們利用分子克隆技術構建了GV230-hCB2真核表達載體，通過脂質體將其轉染到HEK293細胞，并檢測hCB2基因在HEK293細胞中的表達。

1 材料與方法

1.1 材料 人T淋巴細胞(上海博谷生物科技有限公司);大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞株(重慶醫(yī)科大學動物實驗中心);GV230載體及Xhol/Kpnl限制性內切酶(上海吉凱基因化學技術有限公司);pMD18T載體、T4DNA連接酶(大連寶生物工程公司)。逆轉錄cDNA合成試劑盒(蘇州拜吉氏生物科技有限公司);TaqDNA聚合酶、DNA Marker、dNTP、RT-PCR試劑盒(Takara公司);質粒提取試劑盒(Promega公司);脂質體LipofectamineTM2000 Reagent轉染試劑盒、TRIzol試劑、DMEM無酚紅培養(yǎng)基、活性炭處理胎牛血清和膠原酶(Invitrogen公司);hCB2受體多克隆抗體(北京博研科創(chuàng)生物技術公司);辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗(北京中杉金橋公司);熒光標記的羊抗兔IgG(abbkine公司);防熒光淬滅劑(碧云天公司)。引物設計合成由上海英俊公司完成。

1.2 組織總RNA的提取及逆轉錄 T淋巴細胞加裂解液，加入1.0 mL TRIzol，于1.5 mL EP管混勻，靜置5min后加入200 μL氯仿，4℃、12 000 r/min離心15min。取上層水相移入EP管，加入等體積異丙醇，混勻，室溫靜置 10min，再次低溫離心(4℃、12 000 r/min，離心10min)，加入1 mL預冷的0.1%DEPC水配制的75%乙醇洗滌沉淀，生物安全柜風干30min，加入400 μL DEPC處理水溶解沉淀。瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，判斷RNA的完整性。紫外分光光度計測定OD260和OD280值。將提取的 RNA稀釋到濃度為1 μg/μL，進行逆轉錄，反應條件:94℃預變性4min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，74℃延伸 45 s，最后 74℃延伸7min，預期片段長度1 122 bp。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠并用DNA凝膠試劑盒回收純化。操作步驟嚴格按照逆轉錄試劑盒說明書進行，獲得hCB2總cDNA。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計與合成 根據(jù)Genbank公布hCB2基因CNR2(NM_001841)，序列設計hCB2擴增的PCR引物，在上游引物的5'加入XhoI酶切點和下游引物5'加入KpnI酶切點，設計與合成hCB2上游引物CNR2-f:5'-TACCGGACTCAGATCTCGAGATGGAGGAATGCTGGGTGAC-3'(劃線處為XhoI酶切位點)下游引物CNR2-r:5'-GATCCCGGGCCCGCGGTACCGTGCAATCAGAGAGGTCTAG-3'(劃線處為KpnI酶切位點)。

1.4 GV230-hCB2的構建 用XhoI酶和KpnI酶分別雙酶切目的片段和載體GV230，凝膠回收純化酶切產(chǎn)物，將線性化載體DNA和純化PCR產(chǎn)物按摩爾數(shù) 3∶1 比例用 T4 DNA Ligase，27 ℃，連接 2 h，將連接產(chǎn)物GV230-hCB2轉化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，挑取菌落，接種于含Neomycin的LB培養(yǎng)基，倒置平皿，于37℃培養(yǎng)過夜。質粒提取試劑盒提取DNA，雙酶切 GV230-hCB2經(jīng) PCR鑒定后，送上海寶生物工程公司進行測序鑒定。同時轉染空載體GV230做對照。

1.5 hCB2真核轉染 HEK293細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清，1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，接種6孔培養(yǎng)板中(約5×105個/孔)。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱過夜后待細胞融合60%左右按LipofectamineTM2000說明書進行轉染，將重組載體 GV230-hCB2瞬時轉染入HEK293細胞，具體方法按說明書操作。轉染48 h后收集細胞，倒置熒光顯微鏡檢測，隨機選擇5個細胞區(qū)域內視野，計數(shù)綠色熒光細胞數(shù)及總細胞數(shù)，計算綠色熒光細胞發(fā)生率=(綠色熒光細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。并取未轉染HEK293細胞做為對照。

1.6 hCB2真核在HEK293細胞中的表達鑒定 采用Western blotting法。轉染后48 h收集細胞，吸去培養(yǎng)基，加50 uL Buffer，混勻移入 EP管，用100 μL的蛋白裂解液(含1%NP40)溶解后，超聲裂解2min，沸水煮 10min，取 5 μL 蛋白質上樣，經(jīng) 10%SDS-PAGE電泳分離，100 mA，1 h，常規(guī)轉膜至PVDF膜，5%脫脂牛奶TBST緩沖液封閉2 h。加入兔抗hCB2多克隆抗體(1∶500)一抗，4℃孵育過夜。辣根酶標記山羊抗兔IgG(1∶3 000)為二抗，37℃孵育2 h，GAPDH作為內參，ECL發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室內X膠片顯影Western blotting檢測結果，以Band-Scan5.0圖像分析軟件進行掃描分析。

1.7 hCB2受體在HEK293細胞膜的表達檢測 采用CLSM法。制作含綠色熒光融合蛋白構建好的GV230-hCB2表達載體的HEK293細胞爬片，細胞融合至60%～70%時，冰甲醇處理15min，4%多聚甲醛固定，常溫封閉30min。加入一抗兔源 Anti-CB2(1∶100)(0.1 μg/mL)過夜，用 PBS 洗滌 3 次去除未結合一抗，加入熒光標記二抗熒光標記羊抗兔IgG(1∶50)孵育，37 ℃，1 h，避光操作，封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察。

2 結果

2.1 RT-PCR分析擴增目的基因 以人T淋巴細胞總RNA進行RT-PCR所得hCB2擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到1 200 bp大小DNA片段，與目的基因長度(hCB2產(chǎn)物大小:1 122 bp)一致。

2.2 質粒GV230-hCB2克隆與測序結果 重組質粒用XhoI酶和KpnI酶消化后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，分別切出與對應目的基因大小相符條帶，約1.1 kb(hCB2)和5.3 kb(線性GV230-hCB2)處可見兩個DNA條帶，經(jīng)測序分析，結果顯示各連接位點以及閱讀框架正確，序列與對應已知序列相符。表明成功構建質粒。

2.3 真核表達載體GV230-hCB2在HEK293細胞中的表達 將含有GFP標記質粒GV230-hCB2轉染HEK293細胞，轉染后24、48 h均有綠色熒光蛋白表達，轉染率約40%，未轉染質粒HEK293細胞無綠色熒光表達。通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察GV230-hCB2轉染HEK293細胞在細胞內定位，激發(fā)光為594 nm掃描，結果見圖1。

圖1 激光共聚焦顯微鏡樣品的掃描結果

2.4 HEK293細胞膜中hCB2受體表達 正常轉染GV230-hCB2HEK293細胞轉染48 h后進行蛋白檢測，攜帶GV230-hCB2的HEK293細胞檢測到相應受體蛋白表達，表達位置為40 kD。

3 討論

hCB2受體廣泛存在于外周免疫系統(tǒng)及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在正常生理狀態(tài)下hCB2受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)低表達，中樞神經(jīng)系統(tǒng)hCB2表達量與外周免疫系統(tǒng)相比明顯減少，僅為脾臟的3.4%［4］。研究表明，在炎性反應、神經(jīng)病理損傷及神經(jīng)元退行性病變發(fā)生時，中樞神經(jīng)系統(tǒng)hCB2受體表達顯著增加。大鼠亨廷頓舞蹈病模型［5］、阿爾茨海默病模型［6］、大鼠肌萎縮性脊髓側索硬化癥模型和唐氏綜合征患者的神經(jīng)損傷部位均觀察到hCB2受體表達增加［7］。以上研究表明，炎性刺激及神經(jīng)損傷可以誘導hCB2受體表達的增加，表明hCB2受體在病理性疼痛形成過程中發(fā)揮作用，推測hCB2可為治療和預防病理性疼痛的藥物作用靶標。

目前對于hCB2受體激動劑的作用機制尚無定論。有學者提出，hCB2激動后調節(jié)免疫系統(tǒng)，減少炎癥因子如神經(jīng)生長因子、前列腺素、細胞因子及組氨酸等的釋放，最終影響神經(jīng)元的興奮性，從而抑制疼痛的傳遞和產(chǎn)生。也有學者認為，hCB2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和脊髓均存在少量的表達，脂溶性hCB2受體激動劑可以通過血腦屏障，產(chǎn)生中樞鎮(zhèn)痛作用。在神經(jīng)元受損時，小膠質細胞被激活增殖，并往受損神經(jīng)細胞處遷移，在短時間內小膠質細胞的這種變化會對神經(jīng)元起保護作用，但長時間持續(xù)這種狀態(tài)就會加大神經(jīng)損傷程度。有研究結果顯示，hCB2受體激動減少小膠質細胞神經(jīng)毒性因子如NO、致炎細胞因子、活性氧簇等的釋放和分泌，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子合成和釋放，穩(wěn)定神經(jīng)元內環(huán)境的穩(wěn)定，從而抑制神經(jīng)性疼痛及神經(jīng)退行性病變的發(fā)生和發(fā)展［8］。在研究開發(fā)帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)系統(tǒng)老年性疾病的治療藥物中，大麻素類藥物在神經(jīng)保護方面的積極作用也為相關藥物的研究開辟了新道路，與大麻素相關的鎮(zhèn)痛類藥物的研發(fā)也已成為新型鎮(zhèn)痛藥物研發(fā)的一個重要方向［9］。

為進一步探尋hCB2受體介導的生理作用及開發(fā)與hCB2受體相關藥物，本研究克隆了hCB2基因，構建了GV230-hCB2真核表達載體并轉染至HEK293細胞中，經(jīng)篩選，免疫熒光、CLSM和Western blotting等方法鑒定，成功構建了穩(wěn)定表達hCB2受體的細胞模型。為后續(xù)體外研究hCB2的作用機制及配體的篩選奠定基礎。本研究選用的是真核表達載體GV230，其有綠色熒光蛋白標記，為細胞轉染成功與否提供很好的直觀依據(jù);用紅色熒光標記二抗激光顯色，能更好地判斷hCB2在轉染細胞內的表達情況，為鑒定穩(wěn)定表達hCB2受體的細胞株提供了方便。

［1］Woelkart K，Salo-Ahen OM，Bauer R.CB receptor ligands from plants［J］.Curr Top Med Chem，2008，8(3):173-186.

［2］Matsuda LA，Lolait SJ，Brownstein MJ，et al.Structure of a cannabinoid receptor and functional expression of the cloned cDNA［J］.Nature，1990，346(6284):561-564.

［3］Morgan NH，Stanford IM，Woodhall GL.Functional CB2type cannabinoid receptors at CNS synapses［J］.Neuropharmacology，2009，57(4):356-368.

［4］Slavik R，Bieri D，Cermak S，et al.Development and evaluation of novel PET tracers for imaging cannabinoid receptor type 2 in brain［J］.Chimia(Aarau)，2014，68(4):208-210.

［5］D'Addario C，Di Francesco A，Trabace L，et al.Endocannabinoid signaling in Alzheimer's disease:current knowledge and future directions［J］.J Biol Regul Homeost Agents，2013，27(2 Suppl):61-73.

［6］Dowie MJ，Grimsey NL，Hoffman T，et al.Cannabinoid receptor CB2is expressed on vascular cells，but not astroglial cells in the post-mortem human Huntington's disease brain［J］.J Chem Neuroanat，2014，(59-60):62-71.

［7］Sisay S，Pryce G，Jackson SJ，et al.Genetic background can result in a marked orminimal effect of gene knockout(GPR55 and-CB2receptor)in experimental autoimmune encephalomyelitis models of multiple sclerosis［J］.PLoS One，2013，8(10):e76907.

［8］Malfitano AM，Basu S，Maresz K，et al.What we know and do not know about the cannabinoid receptor 2(CB2)［J］.Semin Immunol，2014，26(5):369-379.

［9］Welch SP，Sim-Selley LJ，Selley DE.Sphingosine-1-phosphate receptors asemerging for treatment of pain［J］.Biochem Pharmacol，2012，84(12):1551-1562.