賈長(zhǎng)河，劉志亮，張成偉

(1河南省人民醫(yī)院，鄭州450003;2加拿大多倫多大學(xué)醫(yī)學(xué)生物物理系;3加拿大多倫多瑪格麗特公主癌癥中心)

胰腺癌是預(yù)后最差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，5年生存率低于5%，故早期診斷胰腺癌尤其重要，但其早期診斷困難。目前，基因診斷是其理想的早期診斷方法，如能發(fā)現(xiàn)特異性和敏感性均較高的標(biāo)志性基因，則可實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌的早期診斷。因此，從大量人類基因中篩選出胰腺癌相關(guān)基因顯得愈來愈重要。基因表達(dá)譜芯片技術(shù)為高通量的分析腫瘤變化基因提供了全新的手段，可為研究腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、檢測(cè)以及預(yù)后提供大量的數(shù)據(jù)。2012年1月～2013年2月，我們探討了基因表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選胰腺癌組織和癌旁正常組織基因表達(dá)譜差異的可行性?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 組織來源 同期選擇加拿大多倫多瑪格麗特公主癌癥中心收治的胰腺癌患者4例，均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為胰頭部導(dǎo)管腺癌，術(shù)前均未行放化療。其中，男2例、女2例，年齡(58±18)歲，分化程度:高分化1例、中分化1例、低分化2例。術(shù)中切除的腫瘤標(biāo)本于15～20min內(nèi)快速分揀，分別留取癌旁組織(肉眼觀察距離腫瘤邊緣＞5cm，術(shù)后病理檢查證實(shí)癌旁組織切緣無腫瘤浸潤(rùn))及主要腫瘤組織;將癌旁組織和癌組織均分為兩份:一份液氮凍存?zhèn)溆?，一份送病理科行常?guī)檢查。

1.2 探針制備及芯片雜交 TRIzol一步法提取各例胰腺癌組織、癌旁正常組織的總RNA，瓊脂糖電泳質(zhì)檢，純化;一步法合成cDNA第1鏈和第2鏈;aaUTP標(biāo)記cRNA合成;cRNA純化;cRNA濃度測(cè)定;cRNA樣品后標(biāo)記(以Cy3-dUTP標(biāo)記癌旁正常胰腺組織樣品，以Cy5-dUTP標(biāo)記胰腺癌組織樣品);熒光標(biāo)記cRNA樣品純化;熒光分子濃度及摻入率計(jì)算;cRNA樣品片段化。最后將探針加在基因芯片上，恒溫雜交爐內(nèi)65℃、10 r/min滾動(dòng)雜交17 h后，揭開蓋玻片，按順序分別在洗液1和洗液2中各洗滌1min，室溫晾干。為消除對(duì)照樣本個(gè)體差異，對(duì)照標(biāo)本采用TRIzol提取組織總RNA后混合為一個(gè)樣本作為統(tǒng)一對(duì)照。以上操作參照試劑盒說明書進(jìn)行。全人類基因芯片4×44K購(gòu)自美國(guó)Agilent公司(G4845A，含27 958個(gè)靶基因)。

1.3 熒光掃描和數(shù)據(jù)分析 ScanArray GX掃描儀掃描芯片，ScanArray Express3.0軟件分析提取兩種熒光信號(hào)強(qiáng)度值，滿足以下2個(gè)條件的作為有效基因點(diǎn):①該基因點(diǎn)的Cy3、Cy5信號(hào)值皆＞200，或者其中之一＞800;②采用lowess回歸方法標(biāo)準(zhǔn)均一化處理后，該基因點(diǎn)的Cy5/Cy3為0.1～10。芯片上某一點(diǎn)的Cy5/Cy3代表胰腺癌組織與正常胰腺組織基因mRNA表達(dá)豐度之比。符合以下條件的基因群認(rèn)定為差異表達(dá)基因:①熒光表現(xiàn)強(qiáng)度差異達(dá)2倍以上變化(增加2倍或減少2倍的基因);②P＜0.05的基因(Bonferroni方法計(jì)算的假陽(yáng)性概率)。

1.4 差異基因表達(dá)檢測(cè) 采用半定量RT-PCR驗(yàn)證。選取4條不同表達(dá)水平的顯著差異基因，包括上調(diào)基因(CD151、S100A4)和下調(diào)基因(NME3、TIMP-3)各2條，作為驗(yàn)證基因。設(shè)計(jì)相應(yīng)的PCR引物;按RT試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以其為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。其中，CD151:正義鏈:5'-ACCATTGCTAGTGCTGAGCC-3'，反義鏈:5'-AACTTGGGCTGTGTTGGTCT-3'，引物長(zhǎng)度 129 bp;S100A4:正義鏈:5'-CCATCCGATGAAACGTCAAGC-3'，反義鏈:5'-GATGGCTCAGCTGCGAAAGA-3'，引物長(zhǎng)度99 bp;TIMP-3:正義鏈:5'-GGAATTCATGACCCCTTGGCTCGGG-3'，反義鏈:5'-GGAATTCAGGGTCTGGCGCTCAGGG-3'，引 物 長(zhǎng) 度648bp;NME3:正義鏈:5'-CTGCAGCCGGAGTTCAAACC-3'，反義鏈:5'-GTCTGCCCTCCTGTCATTCA-3'，引物長(zhǎng)度187 bp;GADPH內(nèi)參:正義鏈:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，反義鏈:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，引物長(zhǎng)度451 bp。反應(yīng)條件:94℃變性10min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，72 ℃1min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)。采用凝膠電泳、Quantity One軟件分析吸光度確定基因表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總RNA質(zhì)量鑒定和mRNA純化 電泳結(jié)果顯示，28S rRNA和18S rRNA條帶清晰，5S rRNA條帶模糊，說明提取的胰腺癌和癌旁正常胰腺組織的總RNA純度和完整性好，符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 基因表達(dá)譜分析 4次芯片雜交結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照信號(hào)清晰，陰性對(duì)照信號(hào)均很低，數(shù)據(jù)可靠。4例患者差異表達(dá)基因取交集，共發(fā)現(xiàn)46個(gè)共同表達(dá)差異基因。其中，腫瘤組織表達(dá)上調(diào)基因有26個(gè)(包括已知基因 17個(gè)，如 GRB2、ITGA3、MMP-14、S100A4、VEGFA、CCNC、MKI67、PCNA、CDK4、MCM4、HSP90AA1、BCL2、CD151、PRPS1、HRH1、GDF15、RPA3)，下調(diào)基因有20個(gè)(包括已知基因10個(gè)，如 PLCB4、TIMP3、BTG2、TFF1、CLDN3、ITGB8、NME3、AKT3、FHIT、ATP4B)。

2.3 差異基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 CD151、S100A4在胰腺癌組織中呈高表達(dá)，NME3、TIMP-3在胰腺癌組織中呈低表達(dá)，與基因芯片結(jié)果吻合，說明芯片結(jié)果可靠。見表1。

表1 4條顯著差異表達(dá)基因RT-PCR半定量分析結(jié)果(±s)

表1 4條顯著差異表達(dá)基因RT-PCR半定量分析結(jié)果(±s)

注:與癌旁正常組織比較，*P＜0.05。

組織類型CD151 S100A4 NME3 TIMP-3胰腺癌組織 8.38±0.81* 7.85±0.39* 1.14±0.15* 1.08±0.17*癌旁正常組織1.04±0.10 1.27±0.18 6.71±0.45 6.69±0.64

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟、多基因參與的復(fù)雜過程，是由一組基因的變化及其相互作用決定的?；蛐酒夹g(shù)可從基因水平對(duì)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為進(jìn)行研究，從幾千或幾萬條基因中篩選出腫瘤相關(guān)基因。而基因表達(dá)譜芯片的應(yīng)用為在全基因組范圍內(nèi)尋找與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的基因變化提供了一個(gè)強(qiáng)有力的手段。

本研究利用美國(guó)Agilent公司生產(chǎn)的全人類基因表達(dá)譜芯片，對(duì)胰腺癌組織和癌旁正常胰腺組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行研究，共發(fā)現(xiàn)46個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因26個(gè)、下調(diào)基因20個(gè);通過RTPCR驗(yàn)證，差異基因 CD151、S100A4、TIMP-3 和NME3的表達(dá)情況與基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果一致。表明胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展與多種腫瘤相關(guān)基因表達(dá)失?；蚰[瘤抑制基因失活有關(guān)，是多個(gè)分子生物學(xué)過程共同作用所致。

在27個(gè)已知基因中，與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有關(guān)的有CCNC、MCM4、RPA3等基因。CCNC是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，有學(xué)者報(bào)道在肝癌細(xì)胞增殖早期表達(dá)增高［1］。MCM4是微小染色體維持蛋白家族中的一員，通過與復(fù)制子結(jié)合在DNA復(fù)制的起始和延伸過程中起著十分關(guān)鍵的作用，能確保DNA的復(fù)制在每個(gè)細(xì)胞周期僅發(fā)生1次，屬于一種與DNA復(fù)制有關(guān)的解鏈酶，在防止DNA過度復(fù)制中起關(guān)鍵作用。MCM4過度表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有密切關(guān)系［2］。以上兩種基因與胰腺癌的關(guān)系鮮見報(bào)道。本研究中，二者在胰腺癌組織中的表達(dá)均上調(diào)。RPA3是真核細(xì)胞中的一種單鏈結(jié)合蛋白，在DNA復(fù)制和修復(fù)過程中起重要作用，對(duì)于細(xì)胞調(diào)控DNA修復(fù)過程至關(guān)重要。有研究顯示，RPA1、RPA2在乳腺癌、肺癌、頭頸部癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等腫瘤中表達(dá)增高［3］，但RPA3在腫瘤中的表達(dá)較少見。本研究首次發(fā)現(xiàn)RPA3在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)。

與細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)有關(guān)的有 ITGA3、S100A4、CD151等基因。ITGA3是一種介導(dǎo)細(xì)胞和其外環(huán)境(如細(xì)胞外基質(zhì))之間連接的跨膜受體;通過與其他蛋白相互作用來介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外聯(lián)系，參與細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、形態(tài)及細(xì)胞周期等調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)，其在胃癌、腸癌及肝癌組織中表達(dá)升高［4］，未見其在胰腺癌組織中表達(dá)的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，該基因在胰腺癌中表達(dá)上調(diào)。S100A4屬于S100鈣結(jié)合蛋白家族成員，參與細(xì)胞骨架及胞膜的相互作用以及鈣離子信號(hào)傳遞和細(xì)胞的分化。S100A4在腫瘤中的作用表現(xiàn)為參與細(xì)胞異常增殖、使侵襲和活動(dòng)能力增強(qiáng)、促進(jìn)新生血管生長(zhǎng)。S100A4在多種腫瘤組織中過度表達(dá)，Lee等［5］研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中S100A4過表達(dá)，與胰腺腫瘤大小、TNM分期及不良預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，S100A4基因在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)。CD151是四次跨膜蛋白超家族成員之一，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的移行及微血管形成起促進(jìn)作用，在血管生成及重塑中起關(guān)鍵作用，有利于腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。目前的研究認(rèn)為，它與腫瘤的發(fā)生及預(yù)后呈正相關(guān)［6，7］。本研究發(fā)現(xiàn)，CD151 基因在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，與 Zhu 等［8，9］報(bào)道一致。

與細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)的有MMP-14、TIMP3基因。MMP-14屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員，能降解多種細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，在多種腫瘤中呈現(xiàn)過度表達(dá)［10］，在胰腺癌組織中的表達(dá)鮮見報(bào)道。本研究中，MMP-14基因在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)。TIMP3屬于基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑家族成員，存在于細(xì)胞外基質(zhì)中，抑制MMP對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，同時(shí)也具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能，在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)［11］。本研究中，TIMP3在胰腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。

與細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡調(diào)節(jié)有關(guān)的有 GDF15、MKI67、BCL2、BTG2、NME3 等基因。GDF15 是 TGF-β超家族成員之一，在生理病理的不同階段，其表達(dá)變化會(huì)通過多條信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞不同的生物行為。目前的研究發(fā)現(xiàn)，其在不同腫瘤組織中表達(dá)不一［12～14］。本研究發(fā)現(xiàn)，GDF15 基因在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)。另外，本研究中MKI67、BCL2在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，BTG2、NME3表達(dá)下調(diào)。

與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的有 AKT3、GRB2、HSP90AA1、HRH1、PLCB4、FHIT 等基因。AKT3 是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、代謝、增殖的作用。目前，關(guān)于AKT3基因的報(bào)道較少，有學(xué)者認(rèn)為其在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。本研究中，AKT3基因在胰腺癌組織中表達(dá)下調(diào);同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GRB2、HSP90AA1、HRH1基因在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)HIT、PLCB4基因表達(dá)下調(diào)。

與細(xì)胞通道傳導(dǎo)及運(yùn)輸有關(guān)的有 ITGB8、ATP4B基因。ITGB8是整合素β家族成員，以往研究未見報(bào)道。本研究，ITGB8基因在胰腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。ATP4B是H+/K+ATP酶家族成員，與腫瘤關(guān)系的研究較少，在胰腺癌未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，ITGB8基因在胰腺癌組織中表達(dá)下調(diào)。

與其他功能有關(guān)的基因有PRPS1、TFF1。本研究中，PRPS1基因在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，TFF1表達(dá)下調(diào)。

綜上所述，應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片可以篩選胰腺癌相關(guān)基因，是否是胰腺癌特異的敏感基因需要更多病例驗(yàn)證以及蛋白水平的進(jìn)一步研究，希望從中能篩選出有助于胰腺癌早期診斷和治療的分子標(biāo)記物或基因治療靶點(diǎn)。

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