劉洋 郭艷玲 姜廣路 孫琦 鄭素華 張宗德

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不同靶點環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌檢測的比較研究

劉洋 郭艷玲 姜廣路 孫琦 鄭素華 張宗德

目的 探討針對hspX、gyrB、IS6110靶基因設(shè)計引物，采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)檢測對結(jié)核病的診斷價值。方法 肺結(jié)核組為我院收治的68例肺結(jié)核患者，對照組為我院收治的45例肺癌患者和20名健康體檢者，收集痰標(biāo)本后采用LAMP、定量PCR及涂片法進行分析，評價LAMP 技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。采用LAMP及定量PCR分別對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的DNA樣品進行檢測，評價LAMP技術(shù)的檢測限；同時對鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌、龜分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌等8種非結(jié)核分枝桿菌菌株及4株普通菌標(biāo)準(zhǔn)株包括大腸埃希菌(ATCC25922)、陰溝腸桿菌(ATCC700323)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC29213)進行鑒定，評價LAMP的敏感度和特異度。結(jié)果 本研究采用hspX、IS6110和gyrB靶基因進行LAMP檢測，對H37Rv的DNA樣品檢測限分別為320 amol/L，320 amol/L和32 amol/L。 LAMP對 8種非結(jié)核分枝桿菌和4種普通菌檢測結(jié)果為陰性。對照組中健康志愿者定量PCR ，涂片法及LAMP 方法的結(jié)果均為陰性，對照組中肺癌患者中hspX，gyrB，IS6110 LAMP 方法和定量PCR陽性結(jié)果2例，3種靶基因位點的LAMP和定量PCR檢測的特異度均為96.9%(63/65)。針對hspX、gyrB、IS6110靶基因進行LAMP檢測，對68例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本檢測的敏感度分別為75.0%(51/68)，77.9%(53/68)，73.5%(50/68)；定量PCR檢測的敏感度為79.4%(54/68)。3種不同基因位點LAMP技術(shù)與定量PCR檢測的敏感度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.82，P>0.05)，但均高于涂片法的38.2%(26/68)，LAMP技術(shù)與涂片法之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.71,χ2=22.02,χ2=17.18,P值均<0.01)。結(jié)論hspX、gyrB、IS6110 LAMP技術(shù)檢測的敏感度和特異度均較高，尤其是針對gyrB靶基因位點進行 LAMP 檢測的敏感度與定量PCR接近，并且高于涂片法；如果結(jié)合不同基因位點LAMP技術(shù)的檢測結(jié)果進行評判可以提高該技術(shù)的敏感度。

結(jié)核分枝桿菌； 核酸擴增技術(shù)； 結(jié)核, 肺/診斷

目前，結(jié)核病仍然是感染性疾病致死的主要原因，特別是在發(fā)展中國家。以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)的細菌學(xué)診斷方法由于結(jié)核分枝桿菌生長較為緩慢，不能為結(jié)核病的診斷提供快速、及時的幫助。因此找到一種快速、準(zhǔn)確、低成本的診斷方法顯得尤為重要。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種比較新型的等溫核酸擴增方法。該方法針對靶基因的特定區(qū)域設(shè)計特異引物，使用鏈置換BstDNA聚合酶在恒溫條件即可完成核酸擴增反應(yīng)，擴增出LAMP特征性梯狀條帶。本研究采用針對3種不同靶基因位點(包括hspX基因、gyrB基因、IS6110基因)設(shè)計引物，采用LAMP方法對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株及臨床痰標(biāo)本進行檢測，評價不同靶基因位點進行LAMP檢測對結(jié)核病的診斷價值。

材料和方法

一、 研究對象

肺結(jié)核組來自2012年3月至12月在我院結(jié)核科就診的肺結(jié)核患者68例，所有患者均經(jīng)涂片法、培養(yǎng)法和放射學(xué)檢查確診，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《肺結(jié)核診斷和治療指南》[1],年齡18～63歲，平均(42±6)歲。對照組包括同期我院收治的肺癌患者45例及我院健康體檢合格的志愿者20名，年齡22～60歲，平均(39.2±5)歲。收集肺結(jié)核患者、肺癌患者和健康志愿者晨痰2～4 ml，采用金胺O染色法進行痰涂片鏡檢，其中涂陽肺結(jié)核患者26例，涂陰肺結(jié)核患者42例，對照組中肺癌患者和健康志愿者涂片均為陰性。本研究經(jīng)北京市胸科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有納入研究者均簽署了知情同意書。

二、分枝桿菌培養(yǎng)和DNA提取

H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株和鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌、龜分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌等8種非結(jié)核分枝桿菌菌株由國家結(jié)核病參比實驗室提供。另外有4株普通菌標(biāo)準(zhǔn)株包括大腸埃希菌(ATCC25922)、陰溝腸桿菌(ATCC700323)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853)和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC29213)。分枝桿菌采用Middlebrook 7H9 液體培養(yǎng)基 (BD公司生產(chǎn)，美國) 進行培養(yǎng)2～3周后，將培養(yǎng)基混勻后分裝、凍存用于提取DNA。大腸埃希菌等4種菌株經(jīng)麥康凱或哥倫比亞培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后進行DNA提取。采用DNA 提取純化試劑盒(QIAamp DNA mini kit，Qiazen公司生產(chǎn)，德國)提取，定量。

痰液標(biāo)本經(jīng)液化處理后進行DNA提取。

三、 定量PCR 反應(yīng)

反應(yīng)在My IQTM iCycler(Bio-Rad公司生產(chǎn)，美國)定量PCR 儀進行。采用SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad公司生產(chǎn)，美國)試劑盒。反應(yīng)體系是20 μl[2]。包括10 μl試劑混合液(Supermix)，8 μl無菌水，1 μl DNA模板，1 μl 10 μmol/L引物(引物序列見表1)。PCR 反應(yīng)條件是: 95 ℃ 10 min，1個循環(huán)； 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

四、 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

LAMP采用熒光目測試劑盒(榮研生物科技有限公司,中國)對臨床痰標(biāo)本及菌株DNA樣本進行測定，具體操作按說明書進行。反應(yīng)體系為25 μl，反應(yīng)條件統(tǒng)一為: 63 ℃ 1 h后80 ℃ 2 min對酶進行滅活(3種基因靶點引物及定量PCR引物序列見表1)。

五、 檢測限測定

1 ml H37Rv菌懸液經(jīng)提取、純化DNA后，定量，將純化的DNA進行10倍連續(xù)倍比稀釋。將稀釋后的DNA 樣品用做標(biāo)準(zhǔn)品用于LAMP 和定量PCR 檢測限的測定[3]。

表1 hspX、gyrB、IS6110靶基因位點進行LAMP檢測所需引物及IS6110定量PCR引物序列

注a：IS6110-LAMP基因；b：定量PCR所用引物基因。FIP和BIP為LAMP前內(nèi)引物和后內(nèi)引物，F(xiàn)3和B3為前外引物和后外引物，環(huán)引物為FL和BL

六、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。3種不同靶基因位點LAMP技術(shù)檢測結(jié)果與定量PCR方法、涂片法檢測結(jié)果之間采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

采用針對3種不同靶基因位點包括hspX、gyrB、IS6110基因設(shè)計引物的LAMP 技術(shù)和定量PCR方法，對H37Rv結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測均為陽性；而鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌、龜分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌等8種非結(jié)核分枝桿菌，以及大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌等4種標(biāo)準(zhǔn)菌株進行檢測，結(jié)果均未見擴增條帶。

檢測限的測定是用來分析LAMP技術(shù)和定量PCR方法在樣品中檢測的最小濃度。通過對連續(xù)倍比稀釋H37Rv DNA 樣品的檢測，hspX和IS6110采用LAMP對DNA樣品的檢測限為320 amol/L，gyrB采用LAMP(圖1)和定量PCR檢測的檢測限為32 amol/L。

第3泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為陰性對照，2為3.2 amol/L； 4～9泳道分別為3.2×106 amol/L，3.2×105 amol/L，3.2×104 amol/L，3.2×103 amol/L，3.2×102 amol/L，3.2×10 amol/L圖1 結(jié)核分枝桿菌H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株gyrB采用LAMP進行檢測的電泳圖

68例肺結(jié)核患者，hspX、gyrB、IS6110采用LAMP 檢測的陽性結(jié)果分別為51、53和50 例。定量PCR 和涂片法的陽性例數(shù)分別為54和26例。hspX、gyrB、IS6110位點LAMP檢測的敏感度分別是75.0%(51/68)、77.9%(53/68)和73.5%(50/68)。如果將3種靶基因檢測結(jié)果進行聯(lián)合評判，則敏感度可以達到82.4%(56/68)。3種不同靶基因位點LAMP檢測的敏感度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.37，P>0.05)，但是均高于涂片法[38.2%(26/68)]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01) (表2)。定量PCR 的檢測敏感度為79.4%(54/68)，與3種不同靶基因位點LAMP檢測的敏感度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.82，P>0.05)。

在26例涂陽肺結(jié)核患者的臨床分離株采用3種靶基因位點進行LAMP檢測的敏感度均為100%(26/26)(表2)。在42例涂陰肺結(jié)核患者的臨床分離株采用3種靶基因位點進行LAMP檢測和定量PCR檢測，敏感度分別為59.5%(25/42)、64.3%(27/42)、 57.1% (24/42)和64.3%(27/42)，LAMP與定量PCR檢測的敏感度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.01，P>0.05)。對照組中健康志愿者采用定量PCR、涂片法及LAMP 方法檢測，結(jié)果均為陰性；對照組中肺癌患者hspX、gyrB、IS6110靶基因采用LAMP和定量PCR檢測，陽性結(jié)果2例，特異度為96.9%(63/65)。

討 論

本研究針對3種不同靶基因位點(包括hspX、gyrB、IS6110 )采用LAMP對結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株、8種非結(jié)核分枝桿菌及大腸埃希菌等4種普通菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進行檢測。結(jié)果表明3種基因位點進行LAMP檢測的特異度較高。在檢測限的分析中，gyrB靶基因位點進行LAMP檢測與定量PCR進行檢測的檢測限相同，其他2種靶基因位點進行LAMP檢測與定量PCR進行檢測的結(jié)果相差一個數(shù)量級。Bi等[4]采用hspX進行LAMP檢測，對牛結(jié)核分枝桿菌的檢測限為500株分枝桿菌/ml，與定量PCR進行檢測的檢測限相同。由于本研究采用H37Rv結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，與Bi等[4]的研究不同；另外可能由于3種靶基因在結(jié)核分枝桿菌基因組的拷貝數(shù)不同導(dǎo)致檢測限存在差異。由于本研究采用統(tǒng)一的反應(yīng)溫度和時間，如果分別對不同靶基因位點進行LAMP檢測的反應(yīng)時間和溫度進行優(yōu)化，會進一步提高各自基因位點進行LAMP檢測的檢測限。

此外，幾種方法進行臨床痰標(biāo)本的檢測表明，LAMP檢測的敏感度較高，3種靶基因位點進行LAMP檢測的敏感度均顯著高于涂片法；尤其是基于gyrB基因的LAMP檢測其敏感度與定量PCR檢測結(jié)果接近，即使檢測涂陰肺結(jié)核患者，LAMP檢測也表現(xiàn)出較好的敏感度，提示具有較大的應(yīng)用價值。Nagdev 等[5]采用針對IS6110基因設(shè)計引物的LAMP技術(shù)對結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液標(biāo)本進行分析，發(fā)現(xiàn)該方法的敏感度為88.23%、特異度為80%。本研究中hspX、gyrB、IS6110進行LAMP檢測的敏感度分別為75.0%(51/68)、77.9%(53/68)、73.5%(50/68)，如果將3種靶基因檢測結(jié)果進行聯(lián)合評判，則敏感度可以達到82.4%(56/68)。如果針對2種以上不同靶基因進行聯(lián)合測定，通過聯(lián)合不同靶基因位點的LAMP檢測結(jié)果進行分析，有可能獲得更高的敏感度和特異度，從而使該技術(shù)成為一種經(jīng)濟可行的肺結(jié)核診斷技術(shù)[4,6-8]。

本研究中對照組中健康志愿者LAMP 方法的檢測結(jié)果均為陰性。對照組中肺癌患者中采用LAMP和定量PCR對2例患者進行檢測，結(jié)果均為陽性；經(jīng)查閱病歷，2例肺癌患者在1年前均有結(jié)核病治療史，分別經(jīng)4個月和6個月抗結(jié)核治療后由涂陽轉(zhuǎn)陰。由于LAMP是針對DNA樣品進行檢測，無法區(qū)分活菌還是死菌，這也是LAMP技術(shù)的缺點之一。在特異度的分析中，對照組納入了肺癌患者和健康志愿者，如果能增加肺炎等其他肺部感染患者將使特異度的分析更加全面。

表2 LAMP、定量PCR和涂片法檢測結(jié)果的比較(例)

注a：表中χ2值為3種LAMP方法及定量PCR技術(shù)分別與涂片法之間敏感度進行比較所得

目前，多個研究結(jié)果表明LAMP檢測在微生物鑒別診斷中有較為廣泛的應(yīng)用前景，包括結(jié)核分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌，甚至是肝炎病毒的檢測[9-13]，由于該方法操作簡單，并且不需特殊儀器，反應(yīng)在1 h 左右即可完成，更適于在臨床大規(guī)模推廣。由于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時間較長，常規(guī)PCR檢測費用較為昂貴，并且需要幾個小時才能完成實驗，如果采用LAMP進行檢測，則可大大縮短反應(yīng)時間，降低檢測成本，更適于對臨床痰等標(biāo)本進行檢測。

總之，hspX、gyrB、IS6110靶基因采用 LAMP檢測的敏感度與定量PCR接近，遠遠好于涂片法，如果聯(lián)合不同靶基因位點進行LAMP檢測，可以提高診斷的敏感度和特異度。并且LAMP技術(shù)操作簡單，適宜于在基層實驗室推廣。

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(本文編輯：范永德)

Detection ofMycobacteriumtuberculosisby loop-mediated isothermal amplification assay targeting different genes

LIUYang,GUOYan-ling,JIANGGuang-lu,SUNQi,ZHENGSu-hua,ZHANGZong-de.

BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversitiy;BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

ZHANGZong-de,Email:zzd417@163.com

Objective To evaluate a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay targeting thehspX,gyrB, andIS6110 genes for the diagnosis of tuberculosis (TB). MethodsMycobacteriumtuberculosispre-sent in sputum samples from 68 pulmonary tuberculosis patients and control groups consisting of 45 lung cancer patients and 20 healthy controls were tested by LAMP, quantitative real-time PCR and smear microscopy to evaluate the value of the LAMP assay. The detection limit of the assay was evaluated by detectingMycobacteriumtuberculosisH37Rv reference strains with PCR and LAMP targeting the three genes. Specificity was evaluated using the follo-wing non-tuberculous mycobacteria (NTM):M.avium,M.intracellulare,M.srofulaceum,M.fortuitum,M.smegmatis,M.marinum,M.chelonaeandM.kansasii, and four other species of bacteria:E.coli(ATCC25922),Enterobactercloacae(ATCC700323),Pseudomonasaeruginosa(ATCC 27853) andStaphylococcusaureus(ATCC29213). Results The H37Rv reference strain was successfully detected by this method and no false-positive results were obtained for NTM or common bacteria. The detection limit of PCR for purified DNA from H37Rv was 32 amol/L and that forhspXLAMP,gyrBLAMP, andIS6110 LAMP were 320 amol/L, 32 amol/L and 320 amol/L, respectively. The detection sensitivity of the three LAMP methods for sputum from 68 pulmonary tuberculosis patients was 75.0% (51/68), 77.9% (53/68), and 73.5% (50/68), all of which were higher than that of smear microscopy, 38.2% (26/68), (χ2=18.71,χ2=22.02,χ2=17.18,P<0.01). There was no significant difference between the sensitivity of LAMP and that of quantitative real-time PCR (χ2=0.82，P>0.05). The specificity of detection usinghspXLAMP,gyrBLAMP, andIS6110 LAMP and PCR was 96.9% (63/65) in each case. Conclusion The sensitivity and specificity of the TB LAMP methods targeting thehspX,gyrBandIS6110 genes were higher than that of smear microscopy and close to that of PCR. Sensitivity could be improved by using a combination of TB LAMP methods targeting different genes.

Mycobacteriumtuberculosis； Nucleic acid amplification techniques； Tuberculosis, pulmonary/diagnosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.08.009

北京市科技新星計劃(2008A040); 北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展專項(ZYLX201304);重大傳染病防治協(xié)同創(chuàng)新中心(PXM2015_014226_000058)

101149 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院流行病學(xué)研究室(劉洋、鄭素華),檢驗科 (郭艷玲)，國家結(jié)核病臨床實驗室(姜廣路)，分子生物學(xué)實驗室(孫琦、張宗德)

注：劉洋與郭艷玲為并列第一作者

張宗德 ，Email: zzd417@163.com

2015-01-07)