梁倩蓉，于曙光，劉順，王國良，鄭曉葉，彭雪美惠，周素明

（寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點實驗室，浙江 寧波315211）

0 引言

可口革囊星蟲Phasolosma esculenta俗稱海丁、土筍等，隸屬星蟲動物門Sipuncula、革囊星蟲綱Phascolosomatidea、革 囊 星 蟲 目 Phascolosomaliformes、革囊星蟲科Phascolosomatidae、革囊星蟲屬Phascolosoma，廣泛分布于我國東南沿海廣西、廣東、海南島、福建和浙江等地，為我國特有種，常供食用［1］，是我國紅樹林區(qū)大型底棲經(jīng)濟(jì)動物之一，棲息于潮間帶營底埋生活，體柔軟蠕蟲狀、長圓筒形，以底棲硅藻和有機(jī)碎屑為食［2］。

近些年對可口革囊星蟲的研究主要集中在組織胚胎學(xué)、體內(nèi)營養(yǎng)成分分析、重金屬毒理學(xué)以及養(yǎng)殖增殖等方面［2－6］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)可口革囊星蟲營養(yǎng)物質(zhì)豐富，其蟲體富含多種人體所需氨基酸，并含有豐富的鈣、磷、鐵等微量元素，牛磺酸以及多種不飽和脂肪酸等。另外，可口革囊星蟲蟲體還存在多種具有抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫以及溶栓作用等［7－8］的生物活性成分。

在抗生素長期使用甚至濫用帶來一系列負(fù)面影響的背景下，抗菌肽、抗菌蛋白等一系列生物來源的新型抗菌物質(zhì)逐漸成為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究熱點，近年來這類抗菌物質(zhì)的相關(guān)研究頻見報道，諸如一些甲殼類、軟體動物、魚類、爬行動物、哺乳動物等生物甚至人類體內(nèi)的多種抗菌活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和分離純化［9］。而無脊椎動物分布廣泛、數(shù)量龐大，且具非特異性免疫防御機(jī)制及相關(guān)活性物質(zhì)，體內(nèi)物質(zhì)組成相對脊椎動物簡單，是為篩選抗菌活性物質(zhì)之良選。可口革囊星蟲作為一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)無脊椎動物，其體壁是主要的食用成分，而體腔液部分在食用過程中基本被丟棄。本研究針對可口革囊星蟲體腔液的抗菌活性進(jìn)行研究，一方面出于對我國特有星蟲種充分利用的考慮；另一方面，也希望通過研究獲得新的抗菌活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌培養(yǎng)

試驗菌種為寧波大學(xué)應(yīng)用海洋生物技術(shù)水產(chǎn)動物病害重點實驗室保存的菌種，詳見表1。

表1 試驗菌株Tab.1 Experimental bacteria strains

培養(yǎng)方式：使用NB或BHI液體培養(yǎng)基以溫度30℃或37℃，轉(zhuǎn)速210r／min振蕩培養(yǎng)試驗菌種24 h；固體培養(yǎng)基采用腦心浸出液瓊脂（Brain Heart Infusion Agar，BHIA）、營養(yǎng)瓊脂（Nutrient Agar，NA）或馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA）培養(yǎng)基。

1.2 可口革囊星蟲體腔液提取物的制備

試驗用健康可口革囊星蟲40余條取自溫嶺塢根鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶，暫養(yǎng)于普通海水中，待其吐盡體內(nèi)濁物后解剖，得到體腔原液。原液處理：（1）僅采取體腔原液5 000r／min離心10min提取的上清液記為T1；（2）超聲波破碎裂解再經(jīng)離心得到的上清液記為T2；（3）用2%乙酸提取的體腔提取液記為T3。上述提取液都可保存在－20℃冰箱待用。

1.3 可口革囊星蟲體腔液提取物的抗菌作用

采用瓊脂徑向擴(kuò)散來確定上述體腔液提取物對不同細(xì)菌或真菌的抗菌效果。瓊脂徑向擴(kuò)散的具體方法：將40mL的BHI、NA或PDA固體瓊脂熔化后冷卻至40℃以下，注入過夜培養(yǎng)菌液1mL，傾倒至平皿中，凝固后用打孔器在含細(xì)菌固體培養(yǎng)基上打孔，每孔滴加25μL體腔液提取物。培養(yǎng)基在30℃或37℃繼續(xù)培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果（下述瓊脂擴(kuò)散方法類似）。

1.4 可口革囊星蟲體腔液提取物抗菌動力學(xué)

將金黃色葡萄球菌（根據(jù)上步實驗確定的典型敏感菌株）培養(yǎng)24h后用PBS緩沖液洗菌2～3次，重旋后將細(xì)菌稀釋至104CFU／mL與T2提取液等體積混勻，分別在孵育0、15、30、45、60、75和90min取100μL進(jìn)行10倍梯度稀釋后涂板計數(shù)，該實驗同時進(jìn)行3次平行實驗。細(xì)菌于37℃恒溫培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果使用SPSS 20.0和Excel進(jìn)行分析處理，下同。

1.5 可口革囊星蟲體腔液抗菌物質(zhì)初步分離

利用商品化超濾離心管（截留分子量分別為3、10、30、50和100kDa）對T2提取液（本實驗抗菌效果最佳組分）進(jìn)行超濾，初步得到2個組分：T2’（濾過液）和T2’’（截留液），利用瓊脂徑向擴(kuò)散方法測定抑菌圈直徑大小，比較分析上述2個組分的抗菌效果。

1.6 可口革囊星蟲體腔液抗菌物質(zhì)的抗菌理化特性

溫度對T2提取液抗菌活性的影響：將星蟲體腔提取物T2液在40、50、60、70和80℃水浴中孵育10min，采用瓊脂徑向擴(kuò)散方法測試抗菌活性隨高溫溫度的變化。將T2液在5、10、15、20、25和30℃培養(yǎng)箱中與細(xì)菌PBS重旋液（稀釋至104CFU／mL）等體積混勻后孵育0.5h，進(jìn)行稀釋涂板計數(shù)（含室溫孵育的對照），比較研究較低溫對T2提取液抗菌活力的影響。實驗組包含3個平行。

T2提取液抗菌活性對金屬離子的依賴性：EDTA是一種常見的可和多種金屬離子結(jié)合形成穩(wěn)定螯合物的金屬螯合劑。本實驗利用EDTA作為可口革囊星蟲體腔提取物中金屬離子的螯合劑，以研究該抗菌活性物質(zhì)對金屬離子的依賴性。將1.0～9.0mmol／L EDTA（aq）分別和T2液孵育0.5h后，以等量0.9%生理鹽水配成的EDTA作為陰性對照，未處理的T2原液為陽性對照，進(jìn)行瓊脂徑向擴(kuò)散，重復(fù)多次。

反復(fù)凍融對T2提取液抗菌活性的影響：反復(fù)室溫解凍，－20℃保存樣品5、6、7、8、9和10次，以0℃解凍樣品作為對照進(jìn)行瓊脂徑向擴(kuò)散比較分析抗菌效果，重復(fù)多次。

2 結(jié)果與分析

2.1 可口革囊星蟲體腔液提取物的抗菌效果比較

通過對抑菌圈直徑的測量結(jié)果顯示，3種體腔液提取物T1（離心上清液），T2（超聲離心破碎上清液）和T3（2%乙酸提取液）表現(xiàn)出不同的抗菌活性，T1和T3的抗菌作用明顯弱于T2，甚至無抗菌活性，而T2的抗菌作用很明顯；且結(jié)果還顯示該抗菌物質(zhì)對不同菌株的抗菌效果也有明顯差異，其對試驗的3種革蘭氏陽性細(xì)菌具有顯著的抗菌效果，而對試驗的3種革蘭氏陰性細(xì)菌及真菌無明顯抗菌效果（表2）。

表2 可口革囊星蟲體腔液不同提取方式的抗菌效果Tab.2 Antibacterial effects of different extractions from coelomic fluid of Phasolosma esculenta

2.2 可口革囊星蟲體腔液抗菌物質(zhì)對金黃色葡萄球菌的抗菌動力學(xué)

為了進(jìn)一步揭示該抗菌活性物質(zhì)抗菌效力隨時間推移的變化趨勢，將金黃色葡萄球菌PBS重旋后用PBS緩沖液稀釋至104CFU／mL與T2提取液等體積混勻，分別在孵育0、15、30、45、60、75和90min取100μL進(jìn)行10倍梯度稀釋后涂板計數(shù)。計數(shù)結(jié)果如圖1所示。圖1結(jié)果顯示隨著孵育時間的增加，活菌量不斷下降，經(jīng)過15min孵育，活菌量明顯下降一半左右（p＜0.01），15min后活菌量減少也很明顯（p＜0.01），孵育90min時活細(xì)菌基本很少。

2.3 抗菌物質(zhì)分子量估計和初步分離

利用商品化3～100kDa截留孔徑的超濾管對可口革囊星蟲T2提取液（T2’為超濾管濾過液，T2’’為上層截留液）進(jìn)行分離和截留（T2’和T2’’等體積）。通過對抑菌圈直徑的測量結(jié)果顯示（表3），3～30kDa超濾管分離所得下層物質(zhì)基本無抗菌活性，而50kDa超濾管分離，下層物質(zhì)開始表現(xiàn)出抗菌活性作用，100 kDa分離所得下層物質(zhì)的抑菌圈明顯比50kDa分離所得的大（p＜0.01），但兩者的抑菌圈分別與對應(yīng)T2原液和上層物質(zhì)的相比較?。╬＜0.01）。結(jié)果表明該抗菌物質(zhì)的分子量大于100kDa。

圖1 可口革囊星蟲體腔液抗菌物質(zhì)對金黃色葡萄球菌的抗菌動力學(xué)Fig.1 Antibacterial kinetics of antibacterial components extracted from coelomic fluid of Phasolosma esculentaagainst Staphylococcus aureus

表3 不同孔徑超濾管分離抗菌物質(zhì)的抑菌圈比較Tab.3 Comparison of bacteriostatic rings of the antibacterial component separated by different diameter ultrafiltration tube

2.4 可口革囊星蟲體腔液抗菌物質(zhì)理化特性研究結(jié)果

2.4.1 溫度對體腔液提取物抗菌活性的影響

瓊脂徑向擴(kuò)散試驗中，溫度在40～50℃仍有抑菌圈，其中40℃抑菌圈和室溫（28℃左右）孵育抑菌圈大小基本相近，60℃抑菌圈已不明顯，而60℃以上基本無抑菌圈，表明該抗菌活性物質(zhì)不耐高溫，具有熱不穩(wěn)定性。而對其在5～30℃條件下涂板計數(shù)以確定最佳抗菌活力溫度結(jié)果如圖2所示，其中25℃時的抗菌率明顯高于其它溫度（p＜0.05），由此可估計該種抗菌活性物質(zhì)發(fā)揮作用的最適溫度約為25℃。

圖2 5～30℃溫度對抗菌物質(zhì)活力的影響Fig.2 Temperature influence on the antibacterial activity within experiment temperature ranging from 5to 30℃

2.4.2 體腔液提取物抗菌活性對金屬離子的依賴性

在含1.0～9.0mmol／L EDTA（aq）的 T2液孵育瓊脂徑向擴(kuò)散實驗中，陰性對照（僅含等濃度的EDTA生理鹽水）無明顯抑菌圈，而含EDTA的T2液的瓊脂附近出現(xiàn)了明顯的抑菌圈，表明主要起到抗菌作用的仍是T2液。通過對抑菌圈直徑的測量結(jié)果顯示，不同EDTA濃度梯度間抑菌圈大小基本無差異，重復(fù)實驗，結(jié)果相同。由此可認(rèn)為金屬離子在該抗菌物質(zhì)發(fā)揮活性作用中不起關(guān)鍵作用。

2.4.3 反復(fù)凍融對體腔液提取物抗菌活性的影響

反復(fù)凍融5～10次后進(jìn)行抗菌實驗，并測量抑菌圈直徑，發(fā)現(xiàn)各抑菌圈差異不大（圖3）。結(jié)果表明該抗菌物質(zhì)不易受反復(fù)凍融的影響。

圖3 反復(fù)凍融對抗菌活性的影響Fig.3 Effects of repeated freezing and thawing on the antibacterial activity

3 討論與結(jié)論

無脊椎動物由于缺乏獲得性免疫僅依靠非特異性免疫系統(tǒng)來抵御外界細(xì)菌等有害生物和物質(zhì)入侵，因此其免疫系統(tǒng)及防御機(jī)制成為目前研究的熱點之一。許多無脊椎動物例如家蠅［10］、環(huán)節(jié)動物［11］，一些貝類［12］、蝦蟹類［13－14］、海膽［15］等體內(nèi)具有多種抗菌活性物質(zhì)。已有學(xué)者在這些生物體內(nèi)分離得到了一些抗菌肽以及活性免疫蛋白。目前研究已得到海洋無脊椎動物抗菌肽主要來源于刺胞類、環(huán)節(jié)類、軟體類、甲殼類和棘皮類，且其中大多數(shù)抗菌肽種類區(qū)別于陸生動物，有防御素、水母素、貽貝素等富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽、沙蠶素、硬皮素和對蝦抗菌素家族、鱟肽素、海膽素等［16］，都具有廣譜抗性?；钚悦庖叩鞍子心?、幾丁質(zhì)、殼聚糖等。其中，蚯蚓體腔液中含有一種分子量約為38kDa，具有破壞非自身細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)能力的膜穿孔蛋白［17］；軟體動物毛蚶的抗菌蛋白組分具有很好的熱穩(wěn)定性，對胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感，對革蘭氏陽性菌和部分真菌表現(xiàn)出抗菌作用，對革蘭氏陰性細(xì)菌則無［18］；BULGAKOV et al［19］從Ruditapes philippinarum體內(nèi)分離得到一種分子量為138kDa，對Ca2＋依賴，具有熱不穩(wěn)定性的C型凝集素 MCL，而 TAKAHASHI et al［20］則從其中分離得到了一種扮演著促進(jìn)血細(xì)胞吞噬作用、分子量為147kDa的新型凝集素MCL－4，說明Ruditapes philippinarum中富含多種不同的免疫活性蛋白；Scylla serrata精漿中存在一種分子量為10.8kDa，不同于在該物種中已分離得到抗菌肽的抗菌蛋白Scygonadin［21］。

可口革囊星蟲是一種低等海洋無脊椎動物，久居灘涂。由于生活環(huán)境復(fù)雜惡劣，其體內(nèi)必然具有一套獨特的防御機(jī)制以抵御致病菌侵染，故而我們推測其體內(nèi)很可能具有抗菌活性物質(zhì)。通過本研究可發(fā)現(xiàn)可口革囊星蟲體腔液中存在著一種抗菌效果顯著的活性物質(zhì)，該結(jié)果證實了之前的推測，而這一類似研究內(nèi)容在國內(nèi)尚未有過相關(guān)報道；在國外雖曾有學(xué)者對星蟲動物門的其它物種進(jìn)行過相關(guān)研究，但是進(jìn)一步深入的研究卻比較少［22－23］。

經(jīng)理化特性等研究結(jié)果分析和比較表明，可口革囊星蟲體腔液中存在一種具有不耐高溫、不依賴金屬離子發(fā)揮作用、抗凍融性強(qiáng)等特性，分子量大于100kDa的抗菌活性物質(zhì)，且該物質(zhì)對金黃色葡萄球菌抗菌作用高效、持久（作用90min后細(xì)菌量明顯降低），在5～30℃范圍內(nèi)最適活性發(fā)揮作用溫度約為25℃。幾種提取方式（離心上清液、超聲離心上清液和2%乙酸提取液）的對比發(fā)現(xiàn)，超聲離心上清液的抗菌作用明顯強(qiáng)于僅經(jīng)離心得到的上清液，不排除因部分體腔細(xì)胞破碎而造成細(xì)胞內(nèi)抗菌物質(zhì)的外流而使得僅離心所得上清液也存在抗菌作用的情況，可以由此推測可口革囊星蟲抗菌活性物質(zhì)主要存在于體腔細(xì)胞內(nèi)。而經(jīng)2%乙酸抽提的體腔液則基本無抗菌效果，表明此抗菌活性物質(zhì)非堿性物質(zhì)。據(jù)以上許多特性與常見廣譜的、耐高溫、堿性、對金屬離子有依賴性的小分子抗菌肽的性質(zhì)［24］不同，可初步判斷該抗菌活性物質(zhì)不是一種抗菌肽而很可能是一種大分子的抗菌蛋白。

對可口革囊星蟲體腔液抗菌活性研究表明，該抗菌物質(zhì)對3種典型革蘭氏陽性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌，海豚鏈球菌和枯草芽胞桿菌）表現(xiàn)出強(qiáng)抗菌活性，而對試驗的3種典型革蘭氏陰性細(xì)菌（大腸桿菌，副溶血弧菌，香魚假單胞菌）和真菌（葡萄牙假絲酵母）則基本無抗菌活性。據(jù)此結(jié)果猜想可口革囊星蟲體內(nèi)抗菌物質(zhì)可能為一種針對革蘭氏陽性細(xì)菌菌體體表某一類特異性位點起作用，從而抑制細(xì)菌生長或者殺死細(xì)菌的物質(zhì)，而不同菌體細(xì)胞壁組成的差異可能是該抗菌物質(zhì)主要針對革蘭氏陽性細(xì)菌起抗菌作用而對革蘭氏陰性細(xì)菌和真菌無抗菌活性的原因所在。

本研究發(fā)現(xiàn)在可口革囊星蟲體腔液中存在對革蘭氏陽性細(xì)菌具有較強(qiáng)抗菌活性的蛋白，并對該蛋白部分理化特性有了一定的了解，這為今后對該抗菌活性蛋白的純化、質(zhì)譜鑒定以及星蟲等海洋蠕蟲類動物的防御機(jī)制深入研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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