劉秀明，王家俊，李源棟，夏建軍，田潤濤，者 為*

1.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明市北市區(qū)紅錦路367號(hào) 650231

2.科邁恩（北京）科技有限公司，北京海淀區(qū)信息路26號(hào)中關(guān)村創(chuàng)業(yè)大廈400室 100080

煙用香精主要用于增進(jìn)卷煙嗅香和抽吸風(fēng)味等，由于其化學(xué)成分復(fù)雜，對(duì)其中一種或幾種化學(xué)成分進(jìn)行定性定量分析，難以有效地控制其品質(zhì)［1］。目前，用于分析香精香料的儀器主要有近紅外光譜儀［2］、高效液相色譜儀（HPLC）［3］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）［4］等。由于香精一般均為揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分，GC/MS分析法較為廣泛采用。色譜指紋圖譜的應(yīng)用是一種有效的品質(zhì)控制方法，但在分析中，無論采用相關(guān)系數(shù)還是矢量夾角余弦來計(jì)算相似度，由于算法本身的問題，其對(duì)數(shù)據(jù)變化不敏感［5］，并且采用單一的某個(gè)方法很難對(duì)指紋圖譜提取物的成分及質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行總體評(píng)價(jià)；若采用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法，可對(duì)其品質(zhì)穩(wěn)定性進(jìn)行適當(dāng)評(píng)價(jià)。主成分分析（Principal component analysis，PCA）是通過對(duì)一組相關(guān)變量進(jìn)行正交旋轉(zhuǎn)等處理，用維數(shù)較少的互不相關(guān)的新變量來反映原變量提供的大部分信息，通過分析新變量達(dá)到解決問題的一種多元統(tǒng)計(jì)方法，已經(jīng)應(yīng)用在許多領(lǐng)域［6-10］。在香精香料品質(zhì)控制方面，文獻(xiàn)［8-9］采用GC/MS及PCA法分別建立了咖啡香精和煙用香精的指紋圖譜，進(jìn)行品質(zhì)控制。Hotelling T2檢驗(yàn)是一種常用多變量檢驗(yàn)方法，是單變量檢驗(yàn)的自然推廣，常用于兩組均向量的比較［11］。因此，將181個(gè)煙用香精樣品直接稀釋進(jìn)樣，采集各個(gè)樣品的GC/MS指紋圖譜，采用PCA分析方法建立3類香精的分類模型，并設(shè)置95%置信限為控制線，99%置信限為預(yù)警線，提取3類香精的Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量，實(shí)現(xiàn)對(duì)香精品質(zhì)的穩(wěn)定監(jiān)控，為香精品質(zhì)控制提供一種簡(jiǎn)單、科學(xué)的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

紅云紅河煙草集團(tuán)在用的不同批次不同風(fēng)格特征的成品香精共181個(gè)，均為液態(tài)。其中，A.“紅河（硬88）”用樣品54個(gè)，B.“紅河（硬99）”用樣品56個(gè)，C.“紅河（硬甲）”用樣品71個(gè)。

乙酸苯乙酯內(nèi)標(biāo)（≥99%，美國Sigma-Aldrich公司）。

6890N/5973N氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司），帶CIS4進(jìn)樣口的TD-2熱解吸系統(tǒng)（德國Gerstel公司）；AB204-S電子分析天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler-Toledo公司）；SIMCA-p11.5+數(shù)據(jù)處理軟件（瑞典Umetrics公司）；ChemPattern化學(xué)計(jì)量學(xué)與化學(xué)指紋圖譜系統(tǒng)解決方案軟件［1.0版，科邁恩（北京）科技有限公司］；有機(jī)相針式過濾頭（25 mm×0.45μm，昆明楚昊經(jīng)貿(mào)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 GC/MS分析

取約2 mL香精樣品，經(jīng)有機(jī)相濾膜過濾后進(jìn)行GC/MS分析。分析條件為：

色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm）；載氣：高純氦（純度≥ 99.999%）；載氣流量：1 mL/min，恒流；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；分流比：10∶1；分流流速：10 mL/min；范圍：29～445 amu；溶劑延遲：14.5 min。

1.2.2 指紋圖譜提取及化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

采用ChemPattern軟件，對(duì)181個(gè)香精樣品的GC/MS指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，確定其共有模式，然后從ChemPattern軟件中，將經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理及色譜峰保留時(shí)間校正對(duì)齊后的色譜數(shù)據(jù)（峰面積）導(dǎo)出至SIMCA-p11.5+，進(jìn)行主成分分析，構(gòu)建3類香精的分類模型，通過提取Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量，監(jiān)測(cè)香精總體品質(zhì)特性的穩(wěn)定性變化趨勢(shì)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化及方法精密度

2.1.1 色譜條件優(yōu)化

香精樣品中溶劑的量很高，為了消除不同種類溶劑的影響，可選擇較大分流比來減小溶劑的影響。然而分流比較大，歧視效應(yīng)也較大，影響香精樣品中一些重要的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低化合物的檢測(cè)。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)3類香精樣品的分流比進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示10∶1的分流比效果較好。

考慮到香精樣品中的成分復(fù)雜，含有大量的低沸點(diǎn)組分，因此選擇較低的起始溫度；另外香精樣品成分的沸程跨度較大，為了達(dá)到快速分離的目的，選擇程序升溫來實(shí)現(xiàn)香精樣品中成分的分離。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)程序升溫的條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件如1.2.1節(jié)所示，既縮短了分析時(shí)間，峰形也較好。

2.1.2 方法的精密度

按照1.2節(jié)的預(yù)處理方法及色譜條件考察儀器精密度、日內(nèi)精密度和日間精密度。①儀器精密度：取1份香精樣品處理后連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算共有色譜峰相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，22個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于5%。②日內(nèi)精密度：取5份同一香精樣品，處理后于同一天內(nèi)分別進(jìn)樣，計(jì)算共有色譜峰相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一天內(nèi)測(cè)定的5個(gè)平行樣品相對(duì)峰面積的RSD均小于10%。③日間精密度：取同一個(gè)香精樣品，隔天測(cè)定1次，共測(cè)定5次，計(jì)算共有峰相對(duì)峰面積的RSD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隔天測(cè)定共5次的樣品共有色譜峰中，相對(duì)峰面積的RSD小于10%的峰占90%，其余峰的相對(duì)峰面積的RSD在10%～15%之間。以上結(jié)果表明儀器精密度較好，方法的日內(nèi)及日間精密度均滿足分析要求。相對(duì)峰面積RSD的最大值、最小值及平均值見表1。

2.2 香精的指紋圖譜提取

色譜指紋圖譜的提取不僅與色譜分離條件有關(guān)，還與軟件對(duì)色譜信息的提取有關(guān)，如何去除干擾，提取足夠的信息量對(duì)化學(xué)計(jì)量學(xué)分析非常重要。本研究中，采用邁恩公司的ChemPattern軟件，對(duì)香精樣品的GC/MS圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行去背景、積分、剪裁、保留時(shí)間校正（對(duì)齊），以及色譜峰數(shù)據(jù)規(guī)范化處理等。

表1 方法的精密度考察（RSD，n=5） （%）

色譜峰保留時(shí)間的漂移現(xiàn)象屬于色譜實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差和不確定性的一部分，在實(shí)驗(yàn)中無法完全避免，當(dāng)待測(cè)組分非常復(fù)雜時(shí)，任何微小的時(shí)間飄移均會(huì)導(dǎo)致樣品間色譜峰匹配錯(cuò)位而造成較大的計(jì)算偏差，因此確立色譜峰正確的對(duì)應(yīng)關(guān)系是順利進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)計(jì)算的先決條件。化學(xué)計(jì)量學(xué)針對(duì)色譜保留時(shí)間的校正提出了不少方法［12-13］。主要是利用加內(nèi)標(biāo)或者找出一些共同的標(biāo)志化合物進(jìn)行校正，使目標(biāo)色譜指紋圖譜與待校準(zhǔn)的色譜指紋圖譜的相關(guān)系數(shù)達(dá)到最大時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)，當(dāng)化合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)差別較大時(shí)易出現(xiàn)錯(cuò)誤匹配。ChemPattern軟件采用近鄰法［14］，基于特定的保留時(shí)間而非圖譜中具體的色譜峰，因此不受樣品圖譜中色譜峰是否發(fā)生變化的影響。圖1是其中一個(gè)樣品保留時(shí)間校正前后色譜峰匹配鏡像圖，圖2是保留時(shí)間校正前后總樣品色譜峰匹配示例圖。可以看出，經(jīng)過手動(dòng)及自動(dòng)調(diào)整，能夠正確地解決峰的保留時(shí)間漂移和重疊峰的問題。圖3為經(jīng)預(yù)處理后部分3類香精樣品的GC/MS指紋圖譜。

2.3 主成分?jǐn)?shù)的選擇與PCA分類模型的建立

應(yīng)用SIMCA-p11.5+軟件中PCA方法，結(jié)合A、B、C 3類香精的GC/MS指紋圖譜，分別建立主成分分類模型，并提取相應(yīng)的Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量作為監(jiān)測(cè)香精品質(zhì)狀態(tài)的統(tǒng)計(jì)量。在PCA分析過程中，選擇適宜主成分?jǐn)?shù)時(shí)，主成分特征值（Eigenvalues）一般需要大于2，同時(shí)應(yīng)兼顧主成分分析對(duì)原色譜數(shù)據(jù)的累積解釋能力和模型的預(yù)測(cè)精度。主成分分析對(duì)色譜數(shù)據(jù)矩陣?yán)塾?jì)解釋能力（R2Xcum）值越接近1，對(duì)模型的解釋能力越好；模型預(yù)測(cè)精度可通過累計(jì)交叉有效性來反映［15］。

分析A、B類香精，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)增到4時(shí)，新增加的第四主成分對(duì)提升模型預(yù)測(cè)精度的貢獻(xiàn)不顯著，所以A、B類香精類模型的適宜主成分?jǐn)?shù)應(yīng)為3。同理C類香精類模型的適宜主成分?jǐn)?shù)應(yīng)為2。選用不同主成分?jǐn)?shù)時(shí)，PCA分類模型的特征值、R2Xcum、Q2和Q2cum見表2。圖4為3類香精的第一、第二主成分得分 t［1］/t［2］分布示意圖。從圖 4 可知，在95%的置信范圍內(nèi)，131個(gè)香精樣品明顯分為3類。

2.4 PCA分類模型的應(yīng)用

分別對(duì)A、B、C 3類香精50個(gè)樣品進(jìn)行Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量監(jiān)測(cè)驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果見表3。設(shè)置95%置信限為控制線，99%置信限為預(yù)警線，A、B類香精的驗(yàn)證樣品均得到正確預(yù)測(cè)。以C類香精為例，圖5為C類香精以PCA分類模型建立的Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量監(jiān)測(cè)示意圖，可用來衡量樣本到主成分空間原點(diǎn)的距離，從而評(píng)估被監(jiān)測(cè)樣品色譜的離散程度。

表2 A、B和C 3類香精PCA類模型的相關(guān)統(tǒng)計(jì)量

表3 3類香精的Hotelling T 2統(tǒng)計(jì)量驗(yàn)證結(jié)果

由圖5可知，C類香精20個(gè)驗(yàn)證樣品中大部分的Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量均在95%（Hotelling T2=6.35）置信范圍內(nèi)波動(dòng)，其中配方錯(cuò)誤的68#、69#、70#3個(gè)樣品超出了控制線95%（Hotelling T2=6.35），被人為錯(cuò)誤歸類的60#樣品超出了預(yù)警線99%（Hotelling T2=9.99），該結(jié)果與68#、69#、70#、60#4個(gè)香精樣品的相對(duì)密度（d2020）及折光指數(shù)（nD20）檢測(cè)值異常情況（相對(duì)偏差絕對(duì)值均大于10%）一致，C類香精4個(gè)樣品的相對(duì)密度及折光指數(shù)結(jié)果見表4。結(jié)果表明：以Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量的99%置信限作為品質(zhì)控制限，95%置信限作為品質(zhì)預(yù)警限，建立的分類模型能正確預(yù)測(cè)C類香精的品質(zhì)波動(dòng)。

表4 4個(gè)香精樣品的相對(duì)密度及折光指數(shù)

3 結(jié)論

①GC/MS指紋圖譜結(jié)合Hotelling T2統(tǒng)計(jì)量建立的香精主成分分類模型，能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)香精品質(zhì)的波動(dòng)情況。②本方法可配合常規(guī)技術(shù)對(duì)香精整體品質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

［1］ 王鈞，趙曰利.浙大中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件在煙用香精香料色譜分析中的引入應(yīng)用［J］.現(xiàn)代儀器，2007，13（3）：47-49.

［2］ 王家俊，邱啟楊，劉巍.FTIR-ATR指紋圖譜的主成分分析-馬氏距離法應(yīng)用于煙用香精質(zhì)量的控制［J］.光譜學(xué)與光譜分析，2007，27（5）：895-898.

［3］ 田海英，宋金勇，王宏偉.RP-HPLC法測(cè)定煙用香精香料中的7種防腐劑［J］.煙草科技，2011（2）：47-5l.

［4］ 張艷芳，鮑峰偉，陳偉華，等.煙用香精香料的GC/MS指紋圖譜［J］.煙草科技，2014（7）：60-63，84.

［5］ 包錦淵，吳啟勛.青海秦艽色譜指紋圖譜的灰色關(guān)聯(lián)分析［J］.上海大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，12（6）：620-623．

［6］ SONG Shiqing，ZHANG Xiaoming，Hayatc K，et al.Coordinating fingerprint determination of solid-phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry and chemometric methods for quality control of oxidized tallow［J］.Journal of Chromatography A，2013，1278：145-152.

［7］ CHEN Yi， ZHU Shangbin， XIE Mingyong， et al.Quality control and original discrimination of Ganodermalucidum based on high-performance liquid chromatographic fingerprints and combined chemometricsmethods［J］.Analytica Chimica Acta，2008，623（2）：146-156.

［8］ 鐘科軍，魏萬之，郭方遒，等.GC-MS及主成分分析法用于咖啡香精的指紋圖譜分析和微差樣品的識(shí)別［J］.分析試驗(yàn)室，2006，25（8）：119-122.

［9］ 郭紫明，董道竹，李燕春，等.氣相色譜-質(zhì)譜法和主成分投影分析法用于煙用香精的分析和質(zhì)量控制［J］.理化檢驗(yàn)：化學(xué)分冊(cè)，2008，44（1）：22-27.

［10］黃世杰，許藹飛，王維剛.主成分分析法在煙用香精質(zhì)量控制中的應(yīng)用［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（30）：14537-14538.

［11］莫惠棟.農(nóng)業(yè)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1992：467-509.

［12］蔡澤凡，朱學(xué)峰，賴何季，等.基于小波變換的HPLC指紋圖譜基線漂移的校正［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)：工學(xué)版，2005，35（增刊）：140-142.

［13］Bortolato S A，Arancibia J A，Escandar G M，et al.Time-alignment of bidimensional chromatograms in the presence of uncalibrated interferences using parallel factor analysis application to multi-component determinations using liquid-chromatography with spectrofluorimetric detection［J］.Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems，2010，101（1）：30-37.

［14］李文杰，李文明.基于k-近鄰算法的定位方法設(shè)計(jì)和仿真對(duì)色譜峰進(jìn)行歸屬［J］.計(jì)算機(jī)仿真，2009，26（4）：194-196，351.

［15］李偉，馮洪濤，周桂圓，等.Hotelling T2結(jié)合多組分NIR校正模型在卷煙生產(chǎn)過程質(zhì)量監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用［J］.煙草科技，2014（7）：5-9.