周麗平 侯雙翼 劉勛 李愛國 趙丁源 楊成鳳 張玉 皮琦 羅軍民 彭延

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·論著·

158例涂陰培陽肺結(jié)核患者分離菌株耐藥情況分析

周麗平 侯雙翼 劉勛 李愛國 趙丁源 楊成鳳 張玉 皮琦 羅軍民 彭延

目的 了解湖北省涂陰培陽肺結(jié)核患者分離菌株耐藥水平，為有效控制耐藥結(jié)核病提供依據(jù)。方法 采用WHO推薦的比例法，對湖北省內(nèi)的4個國家級耐藥監(jiān)測點2013年獲得的158例涂陰培陽患者的臨床分離株進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，其中一線抗結(jié)核藥物有異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)4種；二線抗結(jié)核藥物有卡那霉素(Km)、卷曲霉素(Cm)、氧氟沙星(Ofx)、對氨基水楊酸(PAS)、丙硫異煙胺(Pto)5種。采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，對耐藥率的比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果 分離的158 株菌株總體耐藥率為18.99%(30/158)，耐多藥率為1.90%(3/158)，一線藥物S的耐藥率最高為13.29%(21/158)，二線藥物Cm的耐藥率最高為3.80%(6/158)。9種藥物耐藥率由高到低的順位分別為S 13.29%(21/158)、H 9.49%(15/158)、Cm 3.80%(6/158)、R 3.16%(5/158)、PAS 2.53%(4/158)、Km 1.90%(3/158)、E 1.27%(2/158)、Ofx 1.27%(2/158)、Pto 0.63%(1/158)。9種藥物均出現(xiàn)了耐藥菌株，共出現(xiàn)了15種不同耐藥形式。4種一線藥物耐藥率為15.82%，與湖北省1999年耐藥監(jiān)測4種一線藥物初始耐藥率17.5%比較基本持平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.25,P>0.05)。結(jié)論 涂陰培陽肺結(jié)核患者分離株有較高的耐藥率，應(yīng)引起重視，加強監(jiān)測，進行規(guī)范治療和管理。

結(jié)核, 肺； 抗藥性, 細(xì)菌； 微生物敏感性試驗

我國結(jié)核病控制工作已經(jīng)取得較大的成效，實現(xiàn)了階段性目標(biāo)，但耐藥結(jié)核病的流行，為結(jié)核病的有效控制增加了難度。近年來，隨著耐藥結(jié)核病實驗室診斷的逐步開展，全國和各省對結(jié)核病耐藥情況進行了監(jiān)測，但研究數(shù)據(jù)多來源于對涂陽培陽肺結(jié)核患者耐藥情況的分析，對涂陰培陽肺結(jié)核患者耐藥情況尚少見報道。據(jù)我國肺結(jié)核疫情報告顯示，目前全國活動性肺結(jié)核患者中絕大多數(shù)為涂陰肺結(jié)核患者[1]，本研究通過收集158例涂陰培陽肺結(jié)核患者菌株進行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，分析涂陰培陽肺結(jié)核患者耐藥現(xiàn)狀。

材料和方法

一、研究對象

1. 標(biāo)本的來源：湖北省浠水、麻城、天門、隨州4個國家級耐藥監(jiān)測點2013年1月1日至12月31日，共新登記活動性肺結(jié)核患者2677例，發(fā)現(xiàn)涂陽患者470例，涂陽檢出率17.56%(470/2677)，新登記的涂陰肺結(jié)核患者2207例；新登記的涂陰患者中男1613例、女594例，最大年齡88歲，最小年齡8歲，平均年齡(49.36±17.79)歲；將每位涂陰患者收集2份質(zhì)量較好的痰標(biāo)本，進行分離培養(yǎng)，獲得陽性培養(yǎng)物168例，涂陰培陽率為7.61%(168/2207)；將168例陽性培養(yǎng)物送省結(jié)核病參比實驗室進行菌種鑒定和藥敏試驗，轉(zhuǎn)種失敗1例，進行菌種鑒定9株為非結(jié)核分枝桿菌，158株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；對158株結(jié)核分枝桿菌進行一、二線共9種抗結(jié)核藥物的敏感性檢測。

2. 新登記的涂陰培陽肺結(jié)核的界定：指從未用過抗結(jié)核藥物治療或用抗結(jié)核藥物化療不足1個月(因其他疾病應(yīng)用抗結(jié)核藥物治療除外)，痰涂片檢查為陰性，痰培養(yǎng)檢查為陽性的肺結(jié)核。

二、實驗方法

1．涂片、培養(yǎng)和菌種鑒定： 按照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[2]進行。

2. 藥敏試驗： 采用WHO《結(jié)核病藥物耐藥性監(jiān)測指南》[3]推薦的比例法對分離菌株進行藥敏試驗檢測。對異煙肼(H)、利福平(R)、鏈霉素(S)、乙胺丁醇(E)4種一線抗結(jié)核藥物和卡那霉素(Km)、卷曲霉素(Cm)、氧氟沙星(Ofx)、對氨基水楊酸(PAS)、丙硫異煙胺(Pto)5種二線抗結(jié)核藥物進行檢測。各含藥培養(yǎng)基內(nèi)的藥物濃度分別為：H 0.2 μg/ml，R 40 μg/ml，S 4 μg/ml，E 2 μg/ml，Km 30 μg/ml，Cm 40 μg/ml，Ofx 2.0 μg/ml，PAS 1.0 μg/ml，Pto 40.0 μg/ml。結(jié)果判定：以試驗管(含藥培養(yǎng)基)菌落數(shù)與對照管(不含藥培養(yǎng)基)菌落數(shù)之比計算耐藥百分比，若耐藥百分比>1%則認(rèn)為受試菌對該抗結(jié)核藥物耐藥，<1%則為敏感[3-5]。

3．實驗材料：抗酸染色液、酸性羅氏培養(yǎng)基、改良羅氏培養(yǎng)基、菌種鑒定培養(yǎng)基和含藥培養(yǎng)基均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv由國家結(jié)核病參比實驗室提供。

三、質(zhì)量控制

(1) 涂片鏡檢和培養(yǎng)的質(zhì)量保證按常規(guī)國家相關(guān)規(guī)定執(zhí)行[6-7]。(2) 藥敏試驗由國家參比室對湖北省結(jié)核病參比實驗室進行藥敏試驗質(zhì)量控制，參比室藥敏試驗結(jié)果符合率達到要求，方可對收集臨床株進行耐藥性檢測。(3)每批藥敏試驗均用結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv敏感株)檢測含藥培養(yǎng)基的質(zhì)量。試驗中，若高稀釋度菌液在對照培養(yǎng)基上生長<20 CFU/ml，則從對照管傳代培養(yǎng)，重復(fù)試驗。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel建立數(shù)據(jù)庫，對所有數(shù)據(jù)進行雙人錄入和復(fù)核，采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，對耐藥率的比較進行卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、抗結(jié)核藥物在158例涂陰培陽患者中的耐藥率

在158例涂陰培陽菌株中，敏感菌株128株，耐任一藥物菌株30株，總耐藥率為18.99%(30/158)，耐多藥(至少同時耐R+H)菌株3株，耐多藥率為1.90%(3/158)。其中不同形式耐4種一線藥物的耐藥率為15.82%(25/158)，與我省1999年全省耐藥監(jiān)測4種一線藥物初始耐藥率17.5%基本持平，差異無統(tǒng)計學(xué)意義((χ2=0.25,P>0.05)。5種二線藥物的耐藥率6.96%(11/158)，4種一線藥物加Ofx和Km 2種二線藥物的耐藥率為17.72%(28/158)。9種藥物耐藥率由高到低的耐藥順位依次為S、H、Cm、R、PAS、Km、E、Ofx、Pto；S的耐藥率最高[13.29%(21/158)]，Pto的耐藥率最低[0.63%(1/158)]，二線藥物中Cm的耐藥率最高[3.80% (6/158)](表1)。

二、不同抗結(jié)核藥物的耐藥形式在158例涂陰培陽患者中的耐藥率

9種藥物均出現(xiàn)了耐藥菌株，30株耐藥菌株共出現(xiàn)了15種不同耐藥形式，其中單耐藥13株，占43.33%(13/30)，多耐藥14株，占46.67%(14/30)，耐多藥3株,占10.00%(3/30)，對R耐藥的5株菌株中3株同時耐H， 沒有出現(xiàn)廣泛耐藥菌株(表2)。

表1 9種抗結(jié)核藥物在158例涂陰培陽患者中的耐藥率

表2 不同抗結(jié)核藥物的耐藥形式 在158例涂陰培陽患者中的耐藥率

三、不同特征涂陰培陽患者的耐藥情況

患者從未用過藥與用藥<1月，耐藥率分別為19.01%(27/142)和18.75%(3/16)，耐藥率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.00,P>0.05)。不同性別患者耐藥率分別為男19.66%(23/117)、女17.07%(7/41)，耐藥率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.20,P>0.05)。男女的各個年齡組的耐藥率情況見表3。

討 論

我國是全球22個結(jié)核病流行嚴(yán)重的高負(fù)擔(dān)國家之一，同時也是全球27個耐多藥結(jié)核病流行嚴(yán)重的高負(fù)擔(dān)國家之一[8]，耐藥結(jié)核病的增多與傳播已成為全球結(jié)核病發(fā)病率急驟上升的原因之一，特別是耐多藥肺結(jié)核的發(fā)生對結(jié)核病的控制造成了極大的威脅[9]，掌握結(jié)核病疫情和結(jié)核分枝桿菌耐藥情況，對結(jié)核病預(yù)防與控制具有非常重要的意義。目前國內(nèi)外耐藥監(jiān)測報道均以涂陽肺結(jié)核患者及分離菌株耐藥情況為主，本研究對涂陰培陽肺結(jié)核患者耐藥情況進行了分析。

一、耐藥疫情較嚴(yán)重，應(yīng)加強耐藥監(jiān)測

本次涂陰培陽肺結(jié)核患者分離的158株菌株中，9種藥物總耐藥率為18.99%，4種一線藥物耐藥率為15.82%，耐多藥率為1.90%，與我省1999年全省耐藥監(jiān)測4種一線藥物初始耐藥率17.5%(χ2=0.25,P>0.05)和初始耐多藥率2.1%(χ2=0.03,P>0.05)比較基本一致[10]。4種一線藥物加2種二線藥物(Ofx和Km)總耐藥率17.72%，略高于2008年全球72個國家和地區(qū)初治涂陽17.00%的平均總耐藥率[11]。說明湖北省涂陰培陽肺結(jié)核患者分離株耐藥率較高，耐藥疫情比較嚴(yán)重，應(yīng)進一步加強患者的發(fā)現(xiàn)、治療與管理，加強結(jié)核病患者的耐藥監(jiān)測。

二、耐藥譜廣泛，耐藥順位發(fā)生變化

9種藥物均出現(xiàn)了耐藥菌株，且出現(xiàn)了15種不同耐藥形式，說明涂陰培陽菌株耐藥譜廣泛。耐藥率順位前五位為S、H、Cm、R、PAS，其中仍然以S耐藥率為高，目前結(jié)核病常規(guī)治療方案中， S不再是

表3 各年齡組不同性別涂陰培陽患者臨床分離株耐藥率

應(yīng)用于患者治療的必選藥物，因此S高耐藥可能與早期主要應(yīng)用S抗結(jié)核和抗炎治療有關(guān)，同時抗結(jié)核藥物治療不超過1個月與未用過抗結(jié)核藥物治療患者的分離株耐藥情況無差別，均說明患者很可能是由于既往感染了具有耐藥性的菌株，為原發(fā)耐藥，原發(fā)耐藥是耐藥結(jié)核病產(chǎn)生的重要原因[12]。二線藥物中Cm、PAS耐藥率排位靠前，Cm排在總順位第三位，5種二線藥物均出現(xiàn)耐藥，說明我省二線藥物使用廣泛，有待規(guī)范，二線藥物耐藥形式不容樂觀。R耐藥的5株菌株中同時耐H的3株，提示加強涂陰培陽患者的R耐藥監(jiān)測有利于提高耐多藥患者的發(fā)現(xiàn)。

三、年齡組間耐藥率差異有統(tǒng)計學(xué)意義

經(jīng)過單項有序卡方檢驗，年齡對藥敏試驗結(jié)果的影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義。0～歲年齡組耐藥率最低(0.00%)，20～歲年齡組耐藥率最高(29.27%)。與李靜等[13]、黨麗云等[14]、何佩賢等[15]報道的情況類似，可能與該年齡段人群生活壓力大、生活不規(guī)律、一些不良的生活習(xí)慣等導(dǎo)致其抵抗力下降，以及流動性大、集體工作生活機會多導(dǎo)致感染機會增多，治療依從性較差等因素有關(guān)。在我國改革開放、經(jīng)濟發(fā)展的新形勢下耐藥趨勢在發(fā)生改變，應(yīng)加強對20～歲年齡段，特別是男性20～歲年齡段耐藥情況的研究，及時采取干預(yù)措施。

涂陰培陽患者實際上是痰涂片檢查時沒被發(fā)現(xiàn)而通過培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌學(xué)陽性患者。2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，活動性患者中涂陰患者占85.65%，其中涂陰培陽率為14.17%，占活動性患者的比例為12.14%[1]，本研究涂陰培陽率達到7.61%，說明活動性患者中存在相當(dāng)數(shù)量的涂陰培陽患者，亦存在一定數(shù)量的耐藥患者，應(yīng)關(guān)注涂陰培陽患者對結(jié)核病疫情及耐藥結(jié)核病疫情的影響。

通過對涂陰培陽患者耐藥情況的分析，發(fā)現(xiàn)涂陰培陽患者耐藥情況比較嚴(yán)重，提示我們在結(jié)核病防治規(guī)劃制定和結(jié)核病防治策略實施過程中應(yīng)重視涂陰肺結(jié)核患者的發(fā)現(xiàn)，將痰培養(yǎng)檢查納入結(jié)核病常規(guī)檢查項目，提高涂陰培陽患者的發(fā)現(xiàn)率，加強涂陰培陽患者的耐藥監(jiān)測，及早發(fā)現(xiàn)耐藥患者，選擇適當(dāng)?shù)闹委煼桨?，?guī)范的進行治療和管理，從而有效避免涂陰患者因治療不當(dāng)所致的治療失敗，避免耐多藥和廣泛耐多藥患者的產(chǎn)生。

[1] 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室．2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告.中國防癆雜志，2012，34(8)：485-508.

[2] 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程．北京：中國教育文化出版社，2006:46-65.

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[6] 趙雁林，姜廣路，夏輝，等.痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊.北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2008:18-39.

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[11] 中華人民共和國衛(wèi)生部．全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(2007—2008年)．北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：l-57．

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(本文編輯：王然 薛愛華)

Drug resistance analysis of 158 isolated strains from patients with smear-negative and culture-positive tuberculosis

ZHOULi-ping,HOUShuang-yi,LIUXun,LIAi-guo,ZHAODing-yuan,YANGCheng-feng,ZHANGYu,PIQi,LUOJun-min,PENGYan.

InstituteforTuberculosisControlandPrevention,HubeiProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Wuhan430079,China

PENGYan,Email: 68633845@qq.com

Objective To understand the drug-resistant level of strains isolated from patients with smear-ne-gative and culture-positive tuberculosis (TB) in Hubei, and to provide basis for effectively control drug-resistant TB. Methods Proportion method recommended by World Health Organization (WHO) was applied. Drug susceptibility test (DST) of H, R, S, E (the first-line anti-TB drugs) and Km, Cm, Ofx, PAS, Pto (the second-line anti-TB drugs) for 158 isolated strains from patients with smear-negative and culture-positive TB from 4 national drug-resistance monitoring sites in Hubei in 2013 was conducted. Database was established using Excel. Statistical analysis was performed with SPSS 16.0. Chi-square test was used to test drug-resistance rate withP<0.05 as statistically significant difference. Results The overall drug-resistance rate of 158 strains was 18.99% (30/158), and the multi-drug resistant rate was 1.90% (3/158). Specifically, the drug-resistance rates of S and Cm were 13.29% (21/158) and 3.80% (6/158), which were respectively the highest among the first line and the second line drugs. Moreover，the drug-resistance rates of 9 drugs from high to low were S 13.29% (21/158), H 9.49% (15/158), Cm 3.80% (6/158), R 3.16% (5/158), PAS 2.53% (4/158), Km 1.90% (3/158), E 1.27% (2/158), Ofx 1.27% (2/158) and Pto 0.63% (1/158). Drug-resistant strains appeared to 9 drugs, and there were a total of 15 different forms of resistance. All in all, the drug-resistance rate of 4 kinds of first-line drugs was 15.82%, which kept basically balance with the monitoring data 17.5% in Hubei in 1999 (χ2=0.25,P>0.05). Conclusion The drug resistance rates of the isolated strains from patients with smear-negative and culture-positive TB are higher, which should be paid attention to, we should strengthen surveillance, and standardize treatment and management as well.

Tuberculosis, pulmonary； Drug resistance, bacterial； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.06.011

430079 武漢， 湖北省疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病防治研究所

彭延，Email: 68633845@qq.com

2015-01-29)