黃 河，羅 恩

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與多步驟基因突變及表型改變有關(guān)[1]?；蛲蛔儗?dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲與分化能力發(fā)生改變，引起結(jié)腸癌發(fā)生與發(fā)展。經(jīng)典的信號(hào)通路Wnt/b-catenin、TGF-b/BMP、K-RAS、PI3K 等均與結(jié)腸癌發(fā)生有關(guān)[2]。盡管目前診斷技術(shù)進(jìn)步，很多結(jié)腸癌可在早期診斷，但仍有大約1/3患者診斷時(shí)有轉(zhuǎn)移，而復(fù)發(fā)率高達(dá)40%[3]。系統(tǒng)性化療目前對(duì)結(jié)腸癌治療取得一定效果，報(bào)道臨床有效反應(yīng)率在40%～60%[4]。但臨床仍有一些患者對(duì)治療無(wú)反應(yīng)，因此，尋找新的有效治療靶點(diǎn)具有重要的意義。

樹(shù)突棘親和素（spinophilin,Spn）是一種支架蛋白（scaffolding protein），定位于 17q21.33，這一基因區(qū)與細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)及雜合性丟失密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，位于 17q21 的 BRCA1，17q21.3 區(qū)基因缺失，與乳腺癌，前列腺癌及泌尿系腫瘤密切相關(guān)[5]。盡管目前研究報(bào)道Spn蛋白與頭頸部癌[6]、肝癌[7]等惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)，但在結(jié)腸癌組織中Spn蛋白表達(dá)情況及Spn蛋白的臨床病理意義目前并未清楚，為此，本研究對(duì)Spn蛋白在結(jié)腸癌中表達(dá)情況作了深入的分析。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本 收集2013年10月1日～2014年5月1日我院胃腸外科20例手術(shù)切除的結(jié)腸癌患者腫瘤組織、癌旁組織及距癌組織邊緣＞5 cm的正常結(jié)腸組織，標(biāo)本切除后，部分立即放入液氮，備RNA提取使用；部分采用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，4 μm切片備免疫組化用。同時(shí)于我院病理科調(diào)取46例結(jié)腸癌組織石蠟塊行免疫組化分析。所有患者術(shù)前未進(jìn)行放、化療等抗腫瘤治療，所有標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理確診。本組46例結(jié)腸癌患者中，男36例，女 10 例，年齡 17～70（54.36±10.30）歲，中位年齡55歲。結(jié)腸癌的分期按照2010年第7版國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)制定的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒購(gòu)于百泰克生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-qPCRSYBR GreenⅠ檢測(cè)試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司，兔抗人Spn抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組化SP檢測(cè)試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 RNA提取及RT-PCR 用Trizol從結(jié)腸癌組織和癌旁組織樣本中提取總RNA，濃度及純度用分光光度計(jì)檢測(cè)，然后按照試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR中Spn引物序列參考文獻(xiàn)[8]，forward 5＇-GCCCAGCTAATTCAGCAGAC-3＇,reverse 5＇-GGAG CTCCTTGAACTTGTGC-3＇；及內(nèi)參GAPDH引物序列為 ,5＇-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3＇（forward）,5＇-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3＇（reverse）。 每 個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。取2 μg總RNA行RT-PCR，按試劑盒說(shuō)明操作。 mRNA 相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct，△Ct=Ct目的基因-Ct內(nèi)參，△△Ct=△Ct癌-△Ct癌旁。

1.4 免疫組化 按照免疫組化SP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：結(jié)腸癌石蠟切片用二甲苯脫蠟，然后梯度酒精水化，用pH值為6的0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液在95℃抗原修復(fù)10 min，加入1∶100兔抗人Spn單克隆抗體4℃冰箱過(guò)夜，PBS洗3次，5 min/次；然后加入二抗室溫作用30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明采用二甲苯溶液，封片用中性樹(shù)膠。采用空白一抗作為陰性對(duì)照；用已知Spn蛋白表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌切片作陽(yáng)性對(duì)照。

[7]方法評(píng)估染色結(jié)果，采用染色百分比與染色強(qiáng)度相結(jié)合方法。染色百分比評(píng)分：0為沒(méi)有細(xì)胞染色，1為1%～10%細(xì)胞染色，2為11%～50%細(xì)胞染色，3為51%～80%細(xì)胞染色，4為＞80%細(xì)胞染色；染色強(qiáng)度評(píng)分：0為陰性，1為弱陽(yáng)性，2為中等，3為強(qiáng)陽(yáng)性。染色百分比與染色強(qiáng)度評(píng)分結(jié)果相乘，總分為0～12分，總分≤6為陰性，＞6為陽(yáng)性。病理閱片結(jié)果不一致時(shí)，由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師重新評(píng)估并協(xié)商確定。

1.5 Western blot 提取結(jié)腸癌與癌旁組織Spn蛋白，取50 μg蛋白做10%SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜采用聚二氟乙烯（PVDF）膜，采用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST 洗膜 3 次，15 min/次，然后加入兔抗人 Spn（1∶100）及內(nèi)參抗體 GAPDH （1∶1000），4 ℃搖床過(guò)夜。TBST 洗膜后加入相應(yīng) HRP 標(biāo)記的二抗（1∶2000），室溫孵育2 h，然后采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以x±s表示，比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌及癌旁組織中Spn表達(dá)情況 Q-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，20例結(jié)腸癌組織及癌旁組織中，Spn的mRNA僅在2例增高，增高率為10%；Spn的mRNA 在結(jié)腸癌組織相對(duì)表達(dá)量為 1.03±0.16，而在癌旁組織中相對(duì)表達(dá)量為 3.86±0.32。免疫組化檢測(cè)結(jié)果提示，Spn蛋白主要定位于細(xì)胞漿或胞膜，呈淡黃至棕黃，團(tuán)塊或片狀分布，癌組織中呈弱陽(yáng)性或不著色。癌旁組織的Spn陽(yáng)性率為90%（18/20），明顯高于結(jié)腸癌組織的 43.5%（20/46）（圖 1）。 Western blot顯示結(jié)腸癌旁組織Spn蛋白明顯高于結(jié)腸癌組織（圖 2）。

圖1 結(jié)腸癌旁組織及不同分化程度的結(jié)腸癌組織Spn表達(dá)（Envision×200）A：結(jié)腸癌旁組織Spn表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性；B：高分化結(jié)腸癌組織中Spn表達(dá)較弱；C：低分化結(jié)腸癌組織Spn表達(dá)陰性

圖2 Western blot檢測(cè)結(jié)腸癌與癌旁組織Spn蛋白表達(dá)1：癌組織；2：癌旁組織

2.2 結(jié)腸癌組織中Spn低表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 46例結(jié)腸癌組織標(biāo)本中，Spn低表達(dá)20例。分析Spn蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Spn蛋白表達(dá)情況與患者性別、年齡無(wú)關(guān)，但與患者腫瘤分化程度（P=0.002）和浸潤(rùn)情況（P=0.024）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（P=0.014）有關(guān)。盡管Spn蛋白表達(dá)與患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.141），但有轉(zhuǎn)移患者70.6%Spn蛋白陰性表達(dá)，明顯高于48.3%的無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者。見(jiàn)表1。

表1 Spn蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

Spn定位于染色體17q21.33，目前研究發(fā)現(xiàn)這一區(qū)域含有較多的抑癌基因，包括BRCA1、NME1、prohibitin等，其突變被認(rèn)為與惡性腫瘤發(fā)生有關(guān)[8]。目前17q21研究較多的是BRCA1，其突變?cè)谌橄侔┑葠盒阅[瘤中發(fā)揮重要作用。而最近研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤中Spn缺失可能在腫瘤發(fā)生中有重要的作用，在肺癌中報(bào)道Spn突變率高達(dá)53%[9]。但目前已知Spn可與多達(dá)30種蛋白相互作用，包括蛋白磷酸酶 1（protein phosphatase 1，PP1）及 F-actin。

其他的信號(hào)通路包括細(xì)胞骨架和細(xì)胞黏附分子、酶、G蛋白信號(hào)通路、膜受體、離子通路和腫瘤抑制蛋白ARF等。Spn也調(diào)節(jié)著跨膜蛋白，通過(guò)p70S6與細(xì)胞內(nèi)的促有絲分裂的信號(hào)事件相關(guān)。Spn可導(dǎo)致pRb磷酸化，使pRb抑制腫瘤功能喪失有關(guān)，導(dǎo)致惡性腫瘤增殖。Spn可通過(guò)與PP1結(jié)合形成復(fù)合體，抑制PP1磷酸酶活性，通過(guò)干擾線粒體紡錘體，導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中Spn表達(dá)較癌旁明顯減低，而且分化較差的結(jié)腸癌組織中Spn表達(dá)較分化高的Spn蛋白表達(dá)低，表明結(jié)腸癌中存在Spn缺失，而且Spn缺失與結(jié)腸癌惡性進(jìn)展密切相關(guān)。

P53突變可能與Spn缺失導(dǎo)致惡性腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，Spn缺失可促進(jìn)腫瘤發(fā)展，Spn缺失同時(shí)合并P53缺失可明顯促進(jìn)腫瘤發(fā)展。在肺癌中，Spn缺失伴隨著明顯的P53突變。P53突變促進(jìn)Spn缺失致腫瘤發(fā)生的機(jī)制可能與P53增殖抑制作用喪失，導(dǎo)致Spn缺失使惡性腫瘤細(xì)胞增殖密切相關(guān)。而結(jié)腸癌中P53突變率高達(dá)50%，P53突變導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞化療藥物耐藥，與P53調(diào)亡作用喪失有關(guān)，提示結(jié)腸癌中P53突變可能更加促進(jìn)Spn缺失導(dǎo)致的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展。

惡性腫瘤中Spn表達(dá)降低的機(jī)制除了堿基缺失及基因突變外，研究發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)控異常也是重要原因。目前發(fā)現(xiàn)miRNA-106a可靶向作用于Spn，惡性腫瘤中miRNA-106a與Spn存在相反的關(guān)系，miRNA-106a表達(dá)增高可促進(jìn)Spn表達(dá)減低，促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中Spn表達(dá)較癌旁組織中低，而且低表達(dá)Spn與患者不良預(yù)后有關(guān)，表明Spn缺失可能在結(jié)腸癌惡性進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。通過(guò)調(diào)控Spn蛋白表達(dá)，可能對(duì)結(jié)腸癌的治療有一定的價(jià)值。

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