馬苗銳，張莉，吳謐，周立明，張麗霞（華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司/微生物藥物國(guó)家工程研究中心/河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，石家莊 050000）

他克莫司是一種具有強(qiáng)免疫抑制活性的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，臨床上應(yīng)用于器官移植術(shù)后的排斥反應(yīng)和自身免疫性疾病。與同類藥物相比，他克莫司具有較強(qiáng)的免疫抑制作用和較低的不良反應(yīng)，在國(guó)內(nèi)外已成為器官移植免疫抑制療法的一線藥物。他克莫司幾乎不溶于水，水中的溶解度約為1～2μg/ml[1]，平均口服生物利用度約為25%[2]，制劑中往往應(yīng)用各種技術(shù)以提高其溶出度和生物利用度。

他克莫司膠囊首先由日本藤澤制藥公司研發(fā)成功，商品名為普樂(lè)可復(fù)（Prograf），1995年在美國(guó)上市，1998年進(jìn)入中國(guó)市場(chǎng)。他克莫司膠囊屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（BCS）中的第Ⅱ類藥品，即低溶解性、高滲透性藥品。藥物的溶出直接影響其在體內(nèi)的吸收和利用[3]，溶出度試驗(yàn)的深入研究和溶出曲線的精確、客觀繪制，既可初步為體內(nèi)生物利用度研究提供參考，也可以揭示各制劑工藝的差別和內(nèi)在品質(zhì)的優(yōu)劣[4]。故本研究以國(guó)外上市的原研他克莫司膠囊為參比制劑，考察了自研他克莫司膠囊在不同溶出介質(zhì)中的溶出情況，并采用相似因子（f2）法評(píng)價(jià)了其內(nèi)在質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

2690型高效液相色譜（HPLC）儀、2487型紫外檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；RC-806型溶出試驗(yàn)儀、CJL-3型沉降籃（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；TGL-20B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

原研他克莫司膠囊[安斯泰來(lái)制藥（中國(guó)）有限公司，批號(hào):1D5579A，規(guī)格:每粒1mg]；自研他克莫司膠囊（華藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，批號(hào):130501，規(guī)格:每粒1mg）；他克莫司對(duì)照品（華藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司，批號(hào):091229，純度:99.8%）；羥丙基纖維素（HPC，日本曹達(dá)株式會(huì)社）；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取他克莫司對(duì)照品10.14mg，置于50ml量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度；精密量取上述溶液0.7ml，置于50ml量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液20ml，加入溶出介質(zhì)50ml，混勻，即得相應(yīng)的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 將自研他克莫司膠囊置于相應(yīng)溶出介質(zhì)中后，分別于0、15、30、45、60、90min時(shí)取10ml溶出液（同時(shí)補(bǔ)充相應(yīng)同溫新鮮介質(zhì)10ml），以離心半徑為10 cm、3000 r/min離心10min，取上清液2.0ml，加入溶出介質(zhì)5.0ml，混勻，即得相應(yīng)的供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Hypersil C18（150mm×4.6mm；5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-甲醇-水-6%磷酸（46∶18∶36∶0.1，V/V/V/V，pH約3.3），流速:1ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng):210nm；柱溫:50 ℃；進(jìn)樣量:400 μl；取對(duì)照品溶液[溶出介質(zhì)為pH 4.5磷酸溶液（含0.005%HPC），簡(jiǎn)稱B]和供試品溶液（溶出介質(zhì)B，90min時(shí)取樣，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制得）分別按上述色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果，理論板數(shù)按他克莫司峰計(jì)算不低于3000，他克莫司與他克莫司異構(gòu)體Ⅱ的分離度大于1.5，他克莫司峰拖尾因子小于1.5，表明該方法適用性較好。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖a.對(duì)照品溶液；b.供試品溶液；1.他克莫司異構(gòu)體Ⅱ；2.他克莫司Fig 1 HPLC chromatogramsa.reference solution；b.test solution；1.tacrolimus isomerⅡ；2.tacrolimus

2.3 溶出介質(zhì)及溶出度測(cè)定方法

溶出度測(cè)定按照2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄ⅩC第二法（槳法）進(jìn)行。參考《美國(guó)藥典》[5]，分別以pH 1.0鹽酸溶液（含0.005%HPC，簡(jiǎn)稱A）、B、pH 6.8磷酸鹽緩沖液（含0.005%HPC，簡(jiǎn)稱C）和水（含0.005%HPC，簡(jiǎn)稱D）為溶出介質(zhì)，體積為 900ml，溫度為（37±0.5）℃，轉(zhuǎn)速為 50 r/min。以HPLC法為他克莫司含量的檢測(cè)方法。

2.4 濾膜吸附考察

取自研他克莫司膠囊，按“2.3”項(xiàng)下方法，以B 900ml為溶出介質(zhì)，于90min（釋放完全）時(shí)取適量溶出液，分成2份，1份按“2.1.2”項(xiàng)下操作離心處理；另一份分別采用3 μm和0.45 μm混合纖維素酯濾膜濾過(guò)，棄去不同體積的初濾液，取續(xù)濾液測(cè)定溶出度隨初濾體積的變化，結(jié)果見(jiàn)表1。初濾不同體積時(shí)不同孔徑濾膜對(duì)他克莫司的吸附率（吸附率＝│初濾一定體積的溶出度－離心溶出度│/離心溶出度×100%）見(jiàn)圖2。

表1 離心處理及初濾不同體積后自研他克莫司膠囊的溶出度Tab 1 Dissolution of self-prepared Tacroimus capsules with centrifugal treatment and initial filtration of different volume

圖2 不同濾膜對(duì)他克莫司的吸附率Fig 2 Adsorbability rate of different filter membranes to tacroimus

上述結(jié)果表明，濾膜對(duì)他克莫司的吸附作用明顯。初濾6ml時(shí)，3 μm濾膜吸附率在12%左右，初濾50ml達(dá)到吸附飽和；初濾6ml時(shí)，0.45 μm小孔徑濾膜吸附率高達(dá)20%左右，初濾100ml達(dá)到吸附飽和?？梢?jiàn)，達(dá)到飽和時(shí)需要初濾的初濾液體積較大，會(huì)引起累積溶出度的計(jì)算誤差。為保證溶出數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，應(yīng)先對(duì)溶出液進(jìn)行離心操作，取上清液采用HPLC法測(cè)定他克莫司含量，計(jì)算累積溶出度并繪制溶出曲線。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按照“2.1.1”項(xiàng)下方法，分別制備A、B、C、D 4種溶出介質(zhì)的對(duì)照品溶液，于25 ℃下放置6、8、10、12、18、24h后，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在4種溶出介質(zhì)中峰面積的RSD分別為1.75%、1.42%、1.46%和1.57%（n＝6），表明在25℃條件下各對(duì)照品溶液在6～24h內(nèi)穩(wěn)定。

取自研他克莫司膠囊，按“2.3”項(xiàng)下方法，分別以900ml A、B、C、D為溶出介質(zhì)，于90min時(shí)取適量溶出液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備4種溶出介質(zhì)的供試品溶液，于25℃下放置2、4、6、8、12、18、24h后，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在4種溶出介質(zhì)中峰面積RSD分別為1.78%、1.55%、1.22%和1.43%（n＝7），表明在25℃條件下供試品溶液在2～24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取自研他克莫司膠囊1粒，按“2.3”項(xiàng)下方法，溶出介質(zhì)為B 900ml，于90min時(shí)取適量溶出液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，6份供試品溶液峰面積的RSD為0.67%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

2.7 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品貯備液1.0、3.0、5.0、8.0、10.0ml，分別加乙腈稀釋至10.0ml，精密加入溶出介質(zhì)A 25ml，搖勻，制備成他克莫司質(zhì)量濃度為0.08、0.24、0.41、0.65、0.81μg/ml的對(duì)照品溶液；同法制備其他3種溶出介質(zhì)的對(duì)照品溶液。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別以他克莫司的峰面積（y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，ug/ml）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，他克莫司在不同溶出介質(zhì)中的回歸方程見(jiàn)表2。結(jié)果表明，他克莫司質(zhì)量濃度在0.08～0.81μg/ml范圍內(nèi)，在4種溶出介質(zhì)中線性關(guān)系均良好。

表2 自研他克莫司膠囊在4種溶出介質(zhì)中的回歸方程Tab 2 Regression equation of self-prepared Tacrolimus capsules in 4 kinds of dissolution mediums

2.8 方法回收率試驗(yàn)

分別精密稱取他克莫司對(duì)照品6.00、8.06、10.14mg，置于50ml量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度；精密量取上述溶液0.7ml，各3份，分別置于50ml量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度；再精密量取上述溶液20ml，加入含有自研他克莫司膠囊空白制劑的溶出介質(zhì)A 50ml，制備成低、中、高質(zhì)量濃度（0.48、0.64、0.81μg/ml）的供試品溶液。同法制備其他3種溶出介質(zhì)的供試品溶液。25℃放置6h后，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，將測(cè)得值代入“2.7”項(xiàng)下回歸方程，計(jì)算方法回收率。結(jié)果顯示，4種低、中、高質(zhì)量濃度供試品溶液的平均回收率均在98%～102%范圍內(nèi)（RSD為0.7%～1.0%，n＝3），表明在所選擇的溶出條件及測(cè)定條件下，方法準(zhǔn)確度較好。

2.9 定量限試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品貯備液4.0ml于量瓶中，加入含自研他克莫司膠囊空白制劑的溶出介質(zhì)B 10ml，混勻，用溶出介質(zhì)與乙腈的混合溶液（5∶2）稀釋，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，按信噪比為10計(jì)算，他克莫司定量限為12.8 ng。

2.10 溶出曲線的測(cè)定與評(píng)價(jià)

2.10.1 溶出曲線測(cè)定 按“2.1”項(xiàng)下方法制備對(duì)照品和供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下方法及條件測(cè)定溶出度，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算0、15、30、45、60、90min（若溶出度均達(dá)到85%以上，且差值在5%以內(nèi)，試驗(yàn)可提前結(jié)束）時(shí)的溶出度并計(jì)算累積溶出度，繪制溶出曲線。2種制劑在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線見(jiàn)圖3。

2.10.2 溶出曲線評(píng)價(jià)

采用美國(guó)FDA有關(guān)口服固體藥物利用度和生物等效性研究指南推薦使用的f2法[6-7]，評(píng)價(jià)自研他克莫司膠囊的質(zhì)量，計(jì)算公式[8]如下:

其中，Rt為t時(shí)間內(nèi)原研他克莫司膠囊平均累積溶出百分率；Tt為t時(shí)間內(nèi)自研他克莫司膠囊平均累積溶出百分比率；n為取樣點(diǎn)的個(gè)數(shù)（n為3～5，且R＞85%的點(diǎn)不超過(guò)1個(gè)）。若50≤f2＜100，則表示自研他克莫司膠囊與原研他克莫司膠囊溶出行為相似。選擇15、30和60min 3點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算，2種制劑在A、B、C、D 4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線的f2分別為63.1、54.8、56.6、68.3，均大于50，說(shuō)明自研他克莫司膠囊和原研他克莫司膠囊的體外溶出行為具有相似性。但自研他克莫司膠囊和原研他克莫司膠囊的體內(nèi)生物利用度是否等效，有待進(jìn)一步考察。

3 討論

他克莫司難溶于水，故制備他克莫司對(duì)照品時(shí)需加入乙腈溶解；供試品溶液加入一定比例的乙腈，是為了保證供試品溶液和對(duì)照品溶液的溶劑組成一致，避免產(chǎn)生溶劑效應(yīng)造成的測(cè)定誤差。他克莫司有2個(gè)體內(nèi)生物等效的互變異構(gòu)體，在溶液中存在轉(zhuǎn)化平衡[9]，因此供試品溶液需要放置2 h后進(jìn)樣，對(duì)照品溶液需要放置6h后進(jìn)樣，以保證他克莫司及其異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化達(dá)到平衡，進(jìn)而保證測(cè)定的準(zhǔn)確性。

圖3 自研和原研他克莫司膠囊在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線（n＝12）1.溶出介質(zhì)A；2.溶出介質(zhì)B；3.溶出介質(zhì)C；4.溶出介質(zhì)DFig 3 Dissolution curves of self-prepared and original Tacrolimus capsules in 4 kinds of dissolution mediums（n＝12）1.dissolution medium A；2.dissolution medium B；3.dissolution medium C；4.dissolution medium D

他克莫司為大環(huán)內(nèi)酯類化合物，溶出介質(zhì)中加入適量的HPC，可以減少其在試驗(yàn)儀器表面的吸附影響，從而獲得接近100%的方法回收率[10]。由于制成膠囊時(shí)采用了固體分散技術(shù)，使原料藥高度分散在水溶性載體中，比表面能變大，吸附能力增強(qiáng)；又由于自研他克莫司膠囊規(guī)格小，溶出液濃度低，使達(dá)到飽和時(shí)初濾液的體積較大，引起累積溶出度的計(jì)算誤差，因此在測(cè)定溶出曲線時(shí)，建議采用離心處理。在溶出90min時(shí)，他克莫司膠囊釋放完全，溶出液中他克莫司濃度最高，但濾膜吸附仍不能通過(guò)初濾消除。在進(jìn)行溶出度測(cè)定時(shí)，溶出液可以采用合適的濾膜過(guò)濾[11]，但需要充分考慮濾膜的吸附，通過(guò)增加初濾體積，使濾膜達(dá)到吸附飽和。

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