李曉清，應(yīng)堅(jiān)（重慶市中醫(yī)院腫瘤科，重慶 404100）

腎陽虛證在中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究和臨床應(yīng)用中均有重要地位，其模型研究一直是腎陽虛證研究的關(guān)鍵，已有的腎陽虛證模型先后采用了衰老大鼠、外源性藥物、手術(shù)切除性腺等方法[1-4]。上述動(dòng)物模型對(duì)該證型的實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生了重要的促進(jìn)作用。但隨著研究的深入，這些模型某些方面尚不能完全滿足實(shí)驗(yàn)要求:（1）大鼠的遺傳背景復(fù)雜，可能會(huì)對(duì)機(jī)體的發(fā)病及治療反應(yīng)產(chǎn)生影響。（2）腎上腺軸的變化和證型之間的因果關(guān)系不能完全確定。長期生命活動(dòng)中各種應(yīng)激以及腎虛都可能造成HPA軸功能下降。（3）外源性糖皮質(zhì)激素腎陽虛證模型中外源性糖皮質(zhì)激素與腎陽虛證之間因果關(guān)系不直接。糖皮質(zhì)激素不僅可與糖皮質(zhì)激素受體（GR）結(jié)合，而且可與鹽皮質(zhì)激素受體（甚至其他受體）結(jié)合，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生復(fù)雜變化[5-8]。

反義寡核苷酸（AS-ODN）可選擇性抑制目的基因的表達(dá)，但天然AS-ODN的半衰期一般只有15～20min，筆者將AS-ODN經(jīng)硫代磷酸化修飾后，用可降解聚乳酸微球包埋，以達(dá)到持續(xù)、穩(wěn)定地抑制GR表達(dá)的效果。本實(shí)驗(yàn)擬通過小鼠皮下注射AS-ODN聚乳酸可降解微球抑制GR表達(dá)以建立腎陽虛模型。

1 材料

1.1 儀器

55P27型超速冷凍離心機(jī)（日本Hitachi公司）；高效液相色譜儀，包括紫外檢測(cè)器（美國Agilent公司）；DigBeh-LM16型小鼠自主活動(dòng)計(jì)算機(jī)視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

聚乳酸-羥基乙酸共聚物75/25（PLGA75/25，成都一平醫(yī)藥有限公司，黏度:0.2 dl/g，分子質(zhì)量:15000）；Trizol?抽提試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄（RT）試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）試劑盒和DL2000標(biāo)志物（Marker）（日本TaKaRa公司）；AS-ODN（委托北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，批號(hào):2728142，純度:99.9%）。

1.3 動(dòng)物

3周齡C57小鼠30只，♂，體質(zhì)量5～7 g，第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)科外研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（渝）2008-0003。本研究通過我院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)論證。

2 方法與結(jié)果

2.1 AS-ODN聚乳酸可降解微球的制備

根據(jù)Gene bank小鼠基因序列（序列號(hào)為X04435）設(shè)計(jì)，AS-ODN的序列為5′-TAAAAACAGGCTTCTGATCCT-3′，對(duì)所有堿基采用硫代磷酸化修飾（由北京賽百盛基因科技有限公司代為合成）。首先在5ml二氯甲烷中加入50mg丙交酯和己交酯1∶1的共聚物，以及AS-ODN（已硫代磷酸化）的水溶液[5mg AS-ODN+100μl聚乙烯醇（0.4%，m/V）]，以4000 r/min攪拌5min，然后加入160ml水性分散介質(zhì)（0.9%無菌生理鹽水），以6000 r/min攪拌5min，通過溶劑蒸發(fā)形成中心球（直徑在5～15 μm）；以離心半徑6.3 cm、6000～8000 r/min離心10min，水洗3次，冷凍干燥48 h收集，在雙蒸水中洗滌去除未被包裹的AS-ODN，最后冷凍干燥，得可降解微球。采用高效液相色譜法[9-10]測(cè)定其載藥量為9～11.5μg/mg。

2.2 分組與給藥

小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E組，每組6只，以組為單位將小鼠飼養(yǎng)在12h明亮/12h黑暗、恒溫21℃、濕度為55%的清潔級(jí)環(huán)境中，自由攝食和飲水。A組小鼠皮下注射0.2ml生理鹽水，B～E組依次皮下注射AS-ODN聚乳酸可降解微球0.1、0.2、0.4、0.8mg（0.2ml生理鹽水溶解），每周給藥1次，連續(xù)給藥4周。

2.3 指標(biāo)觀察

2.3.1 一般情況 給藥后每日觀察各組小鼠的眼神（眼球運(yùn)動(dòng)）、呼吸、睡眠、皮毛光滑程度等，記錄給藥后每周小鼠的體質(zhì)量，以了解小鼠發(fā)育情況。

2.3.2 活動(dòng)度 給藥4周后，采用多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀進(jìn)行自主活動(dòng)度檢測(cè)，即將小鼠放置于測(cè)量筒內(nèi)靜置5min，然后連續(xù)記錄15min內(nèi)小鼠的活動(dòng)度，計(jì)算每1min平均活動(dòng)度，以“次/min”為單位。

2.3.3 臟器中GR mRNA表達(dá) 給藥4周后取各組小鼠，斷頸處死，收集肝臟、腎上腺、腦等標(biāo)本，按照Trizol?抽提試劑說明書方法提取肝臟、腎上腺、腦組織的RNA。取樣本RNA溶液1μl加入99μl超純水，測(cè)定260nm、280nm波長處光密度（OD），計(jì)算OD260/280比值。若OD260/280比值介于1.8～2.0，表示樣本RNA溶液純度高。按照RT試劑盒產(chǎn)品說明書方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為:30℃10min，42℃20min，99℃5min，4℃5min。反應(yīng)完畢后在－20℃保存。按照PCR試劑盒說明進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5min。PCR引物序列:GR上游引物為5′-AGTTCTCCTCCGTCCAGCTC-3′，下游引物為5′-AACACCTCAGGCTCGATCAC-3′，目的產(chǎn)物大小為414 bp。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）序列:上游引物為 5′-ACCACAGTCCATGCCATCA-3′，下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，產(chǎn)物大小為450 bp。以120 V電壓在加有核酸染料Gold view的2.0%瓊脂糖凝膠上電泳15min，經(jīng)凝膠紫外掃描成像儀觀察，凝膠成像掃描儀分析，記錄積分光密度（IOD）。以GR目的條帶IOD值與GAPDH條帶IOD的比值表示GR mRNA表達(dá)情況。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)用表示，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況

與A組比較，其余組小鼠給藥后在第4周開始逐漸出現(xiàn)體毛稀疏無光澤、拱背、少動(dòng)、扎堆、豎毛、反應(yīng)遲鈍等腎陽虛表現(xiàn)；其體質(zhì)量逐漸減輕，其中B組小鼠從給藥后3周開始減輕，C、D組小鼠從給藥后1周開始減輕，E組小鼠從給藥后2周開始減輕，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組小鼠不同時(shí)期的體質(zhì)量見表1。

表1 各組小鼠不同時(shí)期的體質(zhì)量（，n＝6，g）Tab 1 Weights of mice in all groups at different stages（，n＝6，g）

表1 各組小鼠不同時(shí)期的體質(zhì)量（，n＝6，g）Tab 1 Weights of mice in all groups at different stages（，n＝6，g）

注:與A組比較，＊P＜0.05Note:vs.groupA，＊P＜0.05

組別A組B組C組D組E組7周齡21.50±1.8719.00±1.79＊15.17±2.22＊17.67±2.73＊15.33±1.21＊3周齡6.00±1.795.83±1.766.00±1.416.50±1.876.33±1.634周齡12.12±2.0411.27±1.649.17±6.33＊10.83±1.17＊10.11±1.415周齡18.17±1.7216.33±3.2713.50±1.05＊14.33±2.07＊12.67±1.37＊6周齡20.83±1.4718.50±1.97＊14.67±1.97＊16.33±2.16＊14.83±1.72＊

3.2 小鼠活動(dòng)度變化

A、B、C、D、E組小鼠給藥4周后的活動(dòng)度分別為（2.82±0.75）、（1.42±0.25）、（1.25±0.31）、（1.35±0.21）、（1.51±0.13）次/min。與A組比較，其余組小鼠的活動(dòng)度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.3 小鼠臟器中GR mRNA表達(dá)情況

與A組比較，其余組小鼠肝、腎上腺、腦組織中GR mRNA表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組小鼠肝臟、腎上腺、腦組織中GR mRNA表達(dá)的電泳圖見圖1，表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表2。

圖1 各組小鼠肝臟、腎上腺、腦中GR mRNA表達(dá)的電泳圖注:M表示Marker；1～5依次為A～E組的GAPDH產(chǎn)物；6～10依次為A～E組的GR mRNA產(chǎn)物Fig 1 Electrophoretograms of GR mRNA expression in liver，adrenal gland and brain of mice in all groupsNote:M refers to Marker；1-5 respectively represent the GAPDH products of groups A-E；6-10 respectively represent the GR mRNA products of groupsA-E

表2 各組小鼠肝臟、腎上腺、腦中GR mRNA表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（，n＝6）Fig 2 GR mRNA expressions in liver，adrenal gland and brain of mice in all groups（，n＝6）

表2 各組小鼠肝臟、腎上腺、腦中GR mRNA表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果（，n＝6）Fig 2 GR mRNA expressions in liver，adrenal gland and brain of mice in all groups（，n＝6）

注:與A組比較，＊P＜0.05Note:vs.groupA，＊P＜0.05

組織肝臟腎上腺腦E組0.68±0.10＊0.57±0.08＊0.56±0.09＊A組0.85±0.100.88±0.030.94±0.06 B組0.54±0.04＊0.68±0.05＊0.54±0.04＊C組0.58±0.02＊0.50±0.09＊0.58±0.06＊D組0.63±0.04＊0.52±0.05＊0.70±0.06＊

4 討論

腎陽虛證模型的建立是腎陽虛證試驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。腎陽虛患者GR表達(dá)降低，溫補(bǔ)腎陽能夠提高GR表達(dá)水平[6，11]。由此提出假設(shè):抑制GR的表達(dá)可以作為建立腎陽虛模型的方法。前期研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能提高腎陽虛細(xì)胞GR表達(dá)水平，并呈現(xiàn)出劑量依賴性[8]，在細(xì)胞水平通過抑制GR表達(dá)建立了腎陽虛證模型。本實(shí)驗(yàn)擬在動(dòng)物水平通過抑制GR表達(dá)建立小鼠腎陽虛證模型，希望在一定程度上再次驗(yàn)證假設(shè)。采用遺傳背景單一的C57小鼠復(fù)制模型可以有效地降低遺傳背景復(fù)雜性對(duì)實(shí)驗(yàn)本身的干擾。復(fù)制模型過程中僅抑制GR表達(dá)，影響條件單一，GR表達(dá)抑制與動(dòng)物出現(xiàn)的癥狀之間的因果關(guān)系清楚，也使HPA軸和癥候之間的關(guān)系更加明確。從小鼠幼年開始抑制GR表達(dá)使筆者首次觀察到GR表達(dá)抑制對(duì)小鼠生長發(fā)育的影響，這也符合“腎主生長發(fā)育”的理念。在研究中除A組外，各組小鼠均出現(xiàn)了拱背、少動(dòng)、扎堆、豎毛、體質(zhì)量增長緩慢、發(fā)育遲緩等腎陽虛證的外在表現(xiàn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，與A組相比，其余各組小鼠體質(zhì)量都表現(xiàn)出下降趨勢(shì)，此為抑制GR而影響小鼠生長發(fā)育的表現(xiàn)。

目前主要通過腔室、給藥泵等方式注射AS-ODN，能夠達(dá)到較好的局部基因表達(dá)抑制效果，使基因mRNA表達(dá)水平下降20%～56%[12-13]，但全身基因表達(dá)抑制未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射的方式以達(dá)到全身GR抑制的目的，對(duì)肝、腎上腺、腦組織進(jìn)行GR表達(dá)的測(cè)定結(jié)果均顯示GR表達(dá)下調(diào)。

Islam A等[10]采用AS-ODN聚乳酸可降解微球400μg對(duì)Wistar大鼠顱內(nèi)注射，成功使目的基因mRNA表達(dá)下調(diào)了39%、目的蛋白下降了80%。目前AS-ODN皮下注射抑制GR表達(dá)的有效劑量未見報(bào)道。本文參考文獻(xiàn)[10]，設(shè)立0.1、0.2、0.4、0.8mg 4個(gè)劑量組。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，各個(gè)劑量AS-ODN聚乳酸可降解微球均可抑制GR基因的表達(dá)，GR抑制效果與劑量不完全呈劑量依賴關(guān)系，其中原因有待進(jìn)一步研究。另外，各個(gè)劑量AS-ODN聚乳酸可降解微球均使小鼠表現(xiàn)出發(fā)育遲緩、活動(dòng)度降低等腎陽虛表現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)通過AS-ODN聚乳酸可降解微球皮下注射使小鼠呈現(xiàn)出腎陽虛癥狀，而且與GR基因表達(dá)抑制相關(guān)。這是對(duì)腎陽虛動(dòng)物模型建立的初步探討，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

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