劉才旺 ,郝天波 ,申嫻娟 ,鞠少卿 ,,蘇建友 **
(南通大學(xué)附屬醫(yī)院1醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心,2外科綜合實(shí)驗(yàn)室,江蘇226001;3吳江市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)
結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,在男性腫瘤患者中排名第3位、女性排名第3位[1-2]。結(jié)直腸癌的生存率較低,與早期結(jié)直腸癌很難發(fā)現(xiàn)有很大關(guān)系。結(jié)直腸癌發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期階段且缺乏及時(shí)、有效的標(biāo)準(zhǔn)化治療??山邮芨涡允中g(shù)僅有2/3患者,而術(shù)后復(fù)發(fā)率為30%~50%[3],約50%的患者最終發(fā)展為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌并死于遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]。因此,提高結(jié)直腸癌的早期診斷率、有效的術(shù)后監(jiān)控對(duì)于及時(shí)發(fā)現(xiàn)、治療及改善預(yù)后是至關(guān)重要的。腫瘤標(biāo)志物可作為結(jié)直腸癌輔助診斷的指標(biāo),臨床上應(yīng)用較為廣泛的是癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA),在結(jié)直腸癌的早期輔助診斷中具有一定的意義。然而并非所有結(jié)直腸癌患者都能被CEA檢測(cè)出來,它的敏感性僅為43%[5]。因此,近年來國(guó)內(nèi)外致力積極探索一種創(chuàng)傷性小、敏感、可靠的結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)志物對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行輔助診斷、判斷預(yù)后、病程監(jiān)控,提高結(jié)直腸癌診斷的敏感性。游離DNA(circulating cell-free DNA,cf-DNA)是一種無細(xì)胞狀態(tài)的胞外DNA,主要存在于血液(血清或血漿)、滑膜液和腦脊液等體液中。現(xiàn)普遍認(rèn)為細(xì)胞凋亡和壞死為循環(huán)DNA的主要來源[6],正常組織主要通過細(xì)胞凋亡釋放產(chǎn)生<200bp的較一致短片段DNA[7]。本實(shí)驗(yàn)建立基于ALU序列的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)游離DNA濃度的方法,收集南通大學(xué)附屬醫(yī)院2012年8月—2013年11月結(jié)直腸癌104例血清標(biāo)本經(jīng)病理確診,應(yīng)用該技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸良、惡性腫瘤患者及正常人血清DNA的濃度,以探討血清DNA濃度在結(jié)直腸癌早期輔助診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
1.1 一般資料 結(jié)直腸癌104例中,男58例,女46例,年齡30~88歲。結(jié)直腸良性息肉患者63例中,男44例,女19例,年齡24~84歲。同期門診體檢健康者110例中,男性56例,女性54例,年齡23~84歲。均無自身免疫性疾病和組織損傷的血清標(biāo)本。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有的標(biāo)本在抽血前得到了受試者的知情同意。
1.2 方法 (1)標(biāo)本的采集:采用分離膠的真空采集管收集血液標(biāo)本,1 600g離心10 min后,留取血清2~3m L于高壓滅菌的EP管內(nèi),-80℃凍存?zhèn)溆?。?)血清DNA的提?。簩⒂坞xDNA提取試劑盒內(nèi)的樣品混合液分別加入96孔板的第1及第7列孔中,再分別加入20μL磁珠,200μL血清樣品和314μL混合液(按照10μL蛋白酶K、4μL核酸助沉劑、300μL裂解液的比例預(yù)先混勻)。按表1在96孔板中加入試劑;加完樣的96孔板放入磁珠提取純化系統(tǒng)內(nèi),自動(dòng)化程序結(jié)束后,將第6及第12列的洗脫液轉(zhuǎn)移至干凈的無核酸酶離心管中,-20℃保存?zhèn)溆?。?)實(shí)時(shí)熒光定量PCR:PCR體系為20 μL,包括DNA模板5μL、上引0.5μL、下引0.5μL、SYBR GreenⅠmix 10 μL、dd H2O 4 μL?;靹?,瞬時(shí)離心。反應(yīng)條件為 95℃ 10 min;95℃ 15 s,64℃ 1 min,35 個(gè)循環(huán);64℃~95℃收集熒光繪制熔解曲線,通過熔解曲線驗(yàn)證特異性。
表1 游離DNA提取液的體系
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用Graphpad Prism5版軟件進(jìn)行繪圖。各組血清cf-DNA濃度用中位數(shù)(四分位數(shù)區(qū)間)表示;計(jì)量指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示,兩獨(dú)立樣本比較,采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 線性 將濃度為222μg/m L的人類基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋(0.222~22200 ng/m L)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。ALU115作為引物時(shí),Y=-3.27X+21.56,R2=0.998;根據(jù)擴(kuò)增效率(E%)=(10-1/斜率-1)×100%計(jì)算得出該法擴(kuò)增效率為EALU115%=102.21%,說明該檢測(cè)方法可檢測(cè)血清中不同濃度的cf-DNA,線性良好(圖1)。
圖1 ALU115擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.2 重復(fù)性 以濃度分別為2220、222、22.2 ng/mL的人類基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)液,同一批重復(fù)做20個(gè)測(cè)定,計(jì)算批內(nèi)CV(表2);將3個(gè)濃度的同1份標(biāo)準(zhǔn)品等份分為20份,分別每天5個(gè),連續(xù)測(cè)定4天,以每個(gè)濃度20個(gè)測(cè)定結(jié)果計(jì)算批間CV(表3)。
表2 檢測(cè)的批內(nèi)變異系數(shù)(xˉ±s)
表3 檢測(cè)的批間變異系數(shù)(xˉ±s)
2.3 特異性 如圖2可見,熒光定量PCR熔解曲線單峰特異,說明特異性較好,ALU115熔解溫度為78.03℃左右,ALU247熔解溫度為81.23℃左右。
圖2 ALU115bp擴(kuò)增的熔解曲線
2.4 結(jié)直腸癌、結(jié)直腸息肉與對(duì)照組血清ALU115表達(dá)水平 用上述所建立的方法,對(duì)結(jié)直腸癌患者104例、結(jié)直腸息肉患者63例和正常對(duì)照者110例血清ALU115表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。兩組間用Mann-Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)直腸癌患者血清ALU115水平中位數(shù) 1046.0(582.7~1694.0)ng/mL 顯著高于結(jié)直腸息肉423.3(254.5~608.9)ng/mL和正常對(duì)照組 385.4(205.7~597.1)ng/mL(P 均<0.001),而結(jié)直腸息肉和對(duì)照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。當(dāng)血清ALU115含量為694.0 ng/mL時(shí),約登指數(shù)最大,因而選取694.0 ng/mL作為ALU115的臨界值(圖 3)。
圖3 結(jié)直腸癌、結(jié)直腸息肉和對(duì)照組血清ALU115表達(dá)水平
2.5 ALU115與CEA的聯(lián)合檢測(cè) 結(jié)直腸癌初診患者血清ALU115和CEA二者聯(lián)合檢測(cè)靈敏度、特異性、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別是82.69%、99.09%、91.12%、98.85%和 85.82%,其中靈敏度、準(zhǔn)確度、陰性預(yù)測(cè)值高于兩個(gè)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)(表 4)。
表4 ALU115和CEA聯(lián)合檢測(cè)
在ALU序列的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)血清游離DNA的基礎(chǔ)上,本研究建立了一這種較靈敏、特異、穩(wěn)定的基于ALU序列的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測(cè)血清游離DNA的方法。并采用磁珠法提取血清DNA,這是一種快速、高通量、高產(chǎn)量的自動(dòng)化提取方法。對(duì)于實(shí)驗(yàn)中縮小人為誤差、保證標(biāo)本較高的重現(xiàn)性起到了重要的作用。方法學(xué)的建立為后期的實(shí)驗(yàn)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
在前人研究的基礎(chǔ)上[8-10],我們用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法,擴(kuò)增ALU序列的115bp來檢測(cè)血清DNA的總濃度。之所以選擇ALU序列,是因?yàn)锳LU家族是靈長(zhǎng)類基因組特有的、含量最豐富、最活躍的中度重復(fù)序列。是短散在重復(fù)序列中最大的一個(gè)家族,占人類基因組的5%~10%。以不同的密度分散于整個(gè)基因組中,即基因組全部基因的3/4都和ALU有關(guān)[11]。ALU序列的種屬特異性和高度重復(fù)性能被用于腫瘤標(biāo)本中人類基因組DNA的量化[12]。
在這項(xiàng)研究中,通過自建ALU-qPCR方法檢測(cè)結(jié)直腸癌初診患者104例、結(jié)直腸息肉患者63例和正常對(duì)照者110例血清標(biāo)本中的ALU115水平。結(jié)果表明,結(jié)直腸癌初診患者血清ALU115指數(shù)明顯高于其它兩組(P均<0.001),而結(jié)直腸息肉和對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),以血清ALU115含量694.0 ng/mL作為診斷結(jié)直腸癌初診患者和正常對(duì)照者的臨界值。對(duì)比cf-DNA和傳統(tǒng)的血清標(biāo)志物的敏感性和特異性,表明cf-DNA濃度與CEA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于結(jié)直腸癌早期診斷是一種有潛力的輔助診斷方法。研究結(jié)果顯示將游離DNA濃度和CEA聯(lián)合檢測(cè),能夠在很大程度上提高結(jié)直腸癌的診斷率。這也是首次的研究發(fā)現(xiàn),通過基于ALU序列的游離DNA定量方法與CEA聯(lián)合檢測(cè)提高結(jié)直腸癌的診斷效率。
因此,游離DNA作為一種新型的生物標(biāo)志物,有望在將來單獨(dú)或與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用于結(jié)直腸癌的輔助診斷及預(yù)后判斷。然而,還需要更長(zhǎng)的隨訪期和大規(guī)模的前瞻性研究,進(jìn)一步驗(yàn)證血清游離DNA檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌患者的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[1]Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates ofworldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008[J].Int JCancer,2010,127(12):2893-2917.
[2]Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer JClin,2011,61(2):69-90.
[3]Lawrie CH,Gal S,Dunlop HM,et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Br J Haematol,2008,141(5):672-675.
[4]Mutch MG.Molecular profiling and risk stratification of adenocarcinoma of the colon[J].J Surg Oncol,2007,96(8):693-703.
[5]Keesee SK,Briggman JV,Thill G,et al.Utilization of nuclear matrix proteins for cancer diagnosis[J].Crit Rev Eukaryot Gene Expr,1996,6(2/3):189-214.
[6]Schwarzenbach H,Hoon DS,Pantel K.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients[J].Nat Rev Cancer,2011,11(6):426-437.
[7]Pinzani P,Salvianti F,Zaccara S,et al.Circulating cell-free DNA in plasma ofmelanoma patients:Qualitative and quantitative considerations[J].Clinica Chimica Acta,2011,412(23-24):2141-2145.
[8]Wang BG,Huang HY,Chen YC ,et al.Increased plasma DNA integrity in cancer patients[J].Cancer Res,2003,63(14):3966-3968.
[9]Umetani N,Kim J,Hiramatsu S,et al.Increased integrity of free circulating DNA in sera of patients with colorectal or periampullary cancer:direct quantitative PCR for ALU repeats[J].Clin Chem,2006,52(6):1062-1069.
[10]Umetani N,Giuliano AE,Hiramatsu SH,et al.Prediction of breast tumor progression by integrity of free circulating DNA in serum[J].Journal of Clinical Oncology,2006,24(26):4270-4276.
[11]Cardelli M.Alu PCR[J].Methods Mol Biol,2011,687:221-229.
[12]Qi J,Qian C,ShiW,et al.Alu-based cell-free DNA:a potential complementary biomarker for diagnosis of colorectal cancer[J].Clin Biochem,2013,46(1/2):64-69.