王順業(yè)，徐瑞容，黃紅銘，丁潤生，那文秀，張立娜

（南通大學附屬醫(yī)院血液科，江蘇226001）

多發(fā)性骨髓瘤（multiplemyeloma，MM）是漿細胞惡性增殖性疾病中最常見的一種。近年研究表明MM 中存在 miR-15a，miR-16-1，miR-17-92 家族，miR-32，miR-21等多種miRNA[1]的異常表達。其異常表達會影響MM細胞的生物學功能，促進疾病的發(fā)生發(fā)展，近年來miRNA在MM中越來越受到重視。MiR-17-92家族是原癌基因的多順反子miRNA，位于13號染色體上的第25個開放閱讀框。在人基因組中編碼 miR-17-5P、miR-17-3P、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1、miR-92-1 等 7 個miRNAs。已證實 miR-17-92在肝癌[2]、食管鱗癌[3]等多種惡性腫瘤中過度表達，通過作用于相應靶基因影響惡性腫瘤形成的信號通路，進而影響腫瘤細胞的生物學功能。研究表明miR-17-3P在肝細胞癌[4]、前列腺癌[5]等惡性腫瘤中，通過對不同靶向基因的調(diào)節(jié)作用影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而miR-17-3P對MM腫瘤細胞的影響尚少有研究。本研究觀察了miR-17-3P在MM細胞系中的表達情況及其對MM細胞活力、細胞周期的影響，有利于幫助我們更多的探究miRNA在多發(fā)性骨髓瘤中的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）MM細胞株及對照標本：MM細胞系U266（中科院上海細胞庫），RPMI8226（北京協(xié)和細胞中心），KM3細胞株由上海第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈。對照標本為正常人志愿者骨髓單個核細胞，已取得知情同意。（2）主要試劑：RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清和淋巴細胞分層液（美國GIBCO公司），RT-PCR試劑盒（Fermentas公司），Trizol、轉(zhuǎn)染試劑 lipofectamine2000（invitrogen 公司），MTT試劑、細胞周期試劑（碧云天生物公司），miR-17-3P引物由睿安生物合成，miR-17-3P模擬物和抑制物由百奧生物設計合成。

1.2 方法 （1）細胞培養(yǎng)：多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226、U266、KM3置于含 10%胎牛血清的 RPMI1640培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2飽和濕度進行培養(yǎng)，傳至2～3代進行實驗。（2）RT-PCR法測定miR-17-3P表達水平：Trizol法抽提總RNA，采用RTPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，SYBR Green法進行擴增。MiR-17-3P引物序列為 17-3P-RT：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC TACAAGT-3’；17-3P-F：5’-ACACTCCAGCTGGG actgcagtgaaggcac-3’；17-3P-R：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。內(nèi)參 U6 引物序列為 U6-F：5’-CTCG CTTCGGCAGCACA-3’，U6-R：5’-AACGCTTCACG AATTTGCGT-3’。（3）MiR-17-3P 模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染骨髓瘤細胞株：取對數(shù)生長期U266細胞，以4.0×105/L接種于6孔板中，培養(yǎng)24h。按照lipofectamine2000說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6h換含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后24h，48h，72h收集細胞用于實驗。（4）MTT法檢測細胞增殖活性：轉(zhuǎn)染后細胞更換培養(yǎng)基后，以（3~4）×104/mL接種于96孔板，每孔200μL，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)。24h、48h、72h后分別進行以下步驟：每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL，37℃孵箱中繼續(xù)孵育 4h，終止培養(yǎng)，離心（1000r/min，5min），棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μL DMSO，振蕩10min，使結晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果。以時間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。（5）細胞周期檢測：收集轉(zhuǎn)染后細胞，細胞周期試劑盒進行PI染色，流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用GraphPad.Prism.v5.0軟件，計量資料結果以均數(shù)±標準差（xˉ±s）表示，對多個樣本均數(shù)進行單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MiR-17-3P在骨髓瘤細胞中表達 采用實時熒光定量PCR檢測MM細胞株RPMI8226、U266、KM3及正常人骨髓單個核細胞中miR-17-3P的表達量。發(fā)現(xiàn)MM 細胞株 RPMI8226、U266、KM3中miR-17-3P相對表達量均明顯高于正常人骨髓細胞（圖 1）。

圖1 實時熒光定量PCR檢測miR-17-3P的表達情況（P<0.05）

2.2 MiR-17-3P促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的增殖前期試驗已證實miR-17-3P在U266細胞株中的表達量較高，分別用MiR-17-3P模擬物和抑制物轉(zhuǎn)染U266細胞進行MTT檢測，發(fā)現(xiàn)利用模擬物上調(diào)miR-17-3P后，U266的細胞活力較對照組明顯提高，48h時作用效果最為顯著；相反，下調(diào)miR-17-3P后，U266的細胞活力降低（圖2）。

圖2 MTT檢測細胞增殖活力

2.3 MiR-17-3P對多發(fā)性骨髓瘤細胞周期的影響分別對轉(zhuǎn)染miR-17-3P模擬物和抑制物的U266細胞進行細胞周期檢測（表1）。發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-17-3P后，G1期細胞比例較對照組有所減少，S期細胞比例明顯增多；相反下調(diào)miR-17-3P后，細胞多被阻滯在G1期（圖3）。

表1 細胞周期進行轉(zhuǎn)染miR-17-3P模擬物和抑制物的 U266 細胞的檢測結果（xˉ±s）

圖3 MiR-17-3P對MM細胞周期的影響

3 討 論

已有研究證實，miR-17-92家族與MM的腫瘤發(fā)生學密切相關[6]。在MM中miR-17-92家族的異常表達會大大縮短患者的無進展生存期[7]，對其預后影響較大。最近研究表明，miR-17-92家族的成員之一miR-17與MM患者無進展生存期縮短密切相關，即miR-17與MM患者預后不良有關。Shan SW等[4]在研究肝癌細胞miR-17的生理學作用時指出，表達miR-17前體的轉(zhuǎn)基因小鼠，會同時大量表達成熟體miR-17-5P和過客鏈miR-17-3p。MiR-17-3P作為過客鏈存在，其在腫瘤形成中的作用極易被忽視。我們通過RT-PCR檢測MM細胞株RPMI8226、U266、KM3與正常人骨髓單個核細胞中miR-17-3P的表達量，結果發(fā)現(xiàn)miR-17-3P表達量的升高可能與MM的腫瘤發(fā)生密切相關。

MiRNA在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控基因的表達，我們設計了miR-17-3P模擬物和抑制物來探究miR-17-3P的改變對MM細胞生物學特性的影響。將分別轉(zhuǎn)染miR-17-3P模擬物和抑制物后的U266細胞來探究miR-17-3P對MM細胞活力的影響。發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-17-3P后，U266細胞活力明顯提高，由此認為miR-17-3P可能對MM細胞活力有影響。為了進一步探究miR-17-3P對MM細胞增殖的影響，將分別轉(zhuǎn)染miR-17-3P模擬物，和抑制物的U266細胞在轉(zhuǎn)染后48h進行細胞周期檢測，發(fā)現(xiàn)利用模擬物上調(diào)miR-17-3P后，G1期細胞比例低于S+G2期，細胞多處于增殖期。相反，利用抑制物下調(diào)miR-17-3P后，細胞多被阻滯在G1期，增殖期細胞比例有所減少。研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92家族在細胞內(nèi)表達升高，可能通過促進G1/S期的轉(zhuǎn)變加速細胞周期進程[8]，本實驗的結果證實了這一點。由此說明miR-17-3P影響MM細胞周期，miR-17-3P高表達可能促進MM細胞增殖。

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