盧祖能，袁江，張躍亮，王云甫

胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素誘導(dǎo)重癥肌無力患者胸腺CD4+CD25－T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化

盧祖能1，袁江1，張躍亮2，王云甫2

目的：探索胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）對重癥肌無力（MG）合并胸腺異?；颊咝叵貱D4+CD25－T細(xì)胞誘導(dǎo)生成CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞的研究。方法：以磁珠分選的方法得到胸腺CD4+CD25－T細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞（DC）細(xì)胞，通過不同濃度（0.1、1、10、20 ng/mL）的TSLP活化DC后誘導(dǎo)CD4+CD25－T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分化，以流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞/ CD4+T細(xì)胞比率；RT-PCR檢測Foxp3 mRNA表達(dá)；Western blot法檢測上調(diào)的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的Foxp3蛋白表達(dá)；ELSIA法檢測培養(yǎng)上清IL-10的含量。結(jié)果：10 ng/mL TSLP組、20 ng/mL TSLP組經(jīng)誘導(dǎo)后CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞比例均明顯升高，F(xiàn)oxp3的表達(dá)水平也相應(yīng)增加，IL-10水平升高，與PBS對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：TSLP可以誘導(dǎo)MG合并胸腺異?；颊咝叵貱D4+CD25－T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分化，并促進(jìn)Foxp3的表達(dá)。

重癥肌無力；胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

重癥肌無力（mysasthenia gravis，MG）是一種累及神經(jīng)-肌肉接頭突觸后膜上乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor，AChR），并由AChR抗體介導(dǎo)的細(xì)胞免疫依賴、補(bǔ)體參與的自身免疫性疾病[1]。MG的發(fā)病與胸腺異常有密不可分的關(guān)系，胸腺是中樞免疫耐受的起源，胸腺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）能誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞無能或抑制其增殖，從而維持正常的免疫穩(wěn)態(tài)[2]。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是由胸腺上皮細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素7（interleukin 7，IL-7）樣細(xì)胞因子，前期已有研究證明TSLP能在正常胸腺組織中通過活化樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化成熟[3]，且MG合并胸腺瘤患者的胸腺TSLP的表達(dá)及Treg細(xì)胞的數(shù)量下降[4,5]。本研究通過體外使用TSLP干預(yù)體外培養(yǎng)MG患者合并胸腺瘤患者的胸腺細(xì)胞，觀察Treg細(xì)胞的變化情況，為MG的特異性治療尋找一條新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年7月至2014年7月于湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院就診的確診MG合并胸腺瘤患者7例[6]，男3例，女4例；胸腺切除之前均未行免疫抑制治療，近期無感染；排除其他自身免疫性疾病和近期感染性疾病病史，且無自身免疫性疾病家族史。胸腺切除術(shù)后觀察胸腺標(biāo)本病理變化為胸腺增生（3例）及胸腺瘤（4例），取患者胸腺組織，分離胸腺組織中DC細(xì)胞及CD4+CD25－T細(xì)胞進(jìn)行研究。本研究方案已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，并經(jīng)患者簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及DC細(xì)胞磁珠分選試劑盒、LD柱、MS柱（購于德國Miltenyi Biotec公司），標(biāo)記為FITC-CD4、PE-CD25及PCH101PE-CY5-Foxp3及Foxp3 Fixation／Permeabilization Concentrateand Diluent（均購于美國eBioscience公司），流式細(xì)胞儀（購于美國Beckman Coulter公司），細(xì)胞總RNA提取試劑Trizol、RT-PCR擴(kuò)增試劑盒（購于日本Takara公司），F(xiàn)oxp3和β-actin引物（購于華大基因有限公司），小鼠抗人Foxp3單克隆抗體（購于美國Sigma公司），兔抗人β-actin多克隆抗體（購于博奧森公司），蛋白酶抑制劑Cocktail（購于瑞士Roch公司）、BCA蛋白定量試劑盒（購于美國Thermo公司），化學(xué)發(fā)光試劑盒（購于美國Perinelmer公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞分離磁珠分選胸腺中DC細(xì)胞及CD4+CD25－T細(xì)胞。胸腺單個(gè)核細(xì)胞制備：取MG患者胸腺瘤組織，機(jī)械破碎，金屬網(wǎng)過濾，梯度離心法，制備胸腺單個(gè)核細(xì)胞懸液，PBS懸浮細(xì)胞。CD4+CD25－T細(xì)胞分離：懸浮細(xì)胞中加入適量的生物素標(biāo)記的抗體混合物（包括生物素標(biāo)記的抗小鼠CD8、CD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CD123、TCR以及血型糖蛋白A），混勻，4℃避光孵育10 min。后加入抗生物素磁珠以及PE標(biāo)記的抗CD25抗體，混勻，4℃避光孵育20 min，洗滌1次后懸浮細(xì)胞，用LD柱（Midi分離器）分離出沒有標(biāo)記的CD4+T細(xì)胞群。懸浮所得細(xì)胞，加入抗PE磁珠，混勻，4℃避光孵育15 min后洗滌細(xì)胞，用MS柱（Mini分離器）分離出CD4+CD25－T細(xì)胞和CD4+CD25+Treg細(xì)胞。DC細(xì)胞分離：單個(gè)核細(xì)胞懸液加入抗CD11c磁珠，4℃避光孵育15 min。用MS柱放入MACS分離器槽中，500 μL分選BSA濕潤分選柱，細(xì)胞通過分選柱，500 μL分選BSA沖洗分選柱3次。從MACS分離器槽中取下分選柱，用500 μL含10%FBS的RPMI1640沖洗分選柱，沖洗液即得到分選后的DC細(xì)胞。

1.3.2 淋巴細(xì)胞活力測定利用臺(tái)盼藍(lán)染色法評價(jià)淋巴細(xì)胞活性，各取90 μL細(xì)胞懸液，加入4 g/L臺(tái)盼藍(lán)10 μL，于顯微鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算淋巴細(xì)胞活力。

1.3.3 不同濃度的TSLP活化DC細(xì)胞誘導(dǎo)Tregs分化取分離好的CD4+CD25－T細(xì)胞接種于24孔板，另取分離好的DC細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100 μL，設(shè)為不同濃度的TSLP組（0.1、1、10、20 ng/mL）和PBS對照組。在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，將不同濃度的TSLP活化的DC細(xì)胞離心后，分別加入24孔板中的CD4+CD25－T細(xì)胞中，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)共7 d，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，使用ELISA法進(jìn)行IL-10檢測，收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀、RT-PCR及Western blot檢測。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測收集細(xì)胞，離心棄上清液并用PBS洗3次，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/mL。取100 μL細(xì)胞懸液，加入直標(biāo)抗體CD4-FITC和CD25-PE各1 μL，4℃避光孵育30 min，加2 mL流式染色液，洗滌，300 g/min離心棄上清，重復(fù)1次，加入1 mL Foxp3 Fixation/permeabilization工作液，輕柔吹打均勻，固定細(xì)胞，4℃避光孵育30 min，每管加2 mL permeabilization buffer，室溫下以300 g/min離心5 min，棄上清，重復(fù)1次，加100 μL permeabilization buffer重懸細(xì)胞后，加入細(xì)胞內(nèi)染色抗體Foxp3-PE-CY5，室溫避光孵育20 min，以permeabilization buffer 2 mL洗1次，300 g/min室溫離心5 min，棄上清，加流式染色液2 mL，300 g/min室溫離心5 min，棄上清，500 μL流式染色液重懸細(xì)胞，此后以流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+/CD4+表達(dá)百分率，以CD4+CD25+Foxp3+/CD4+表達(dá)百分率計(jì)為Treg細(xì)胞的相對表達(dá)水平。

1.3.5 RT-PCR檢測Foxp3 mRNA的表達(dá)按RT-PCR操作說明進(jìn)行具體操作。

Foxp3上游引物（5'～3'）為TGACCAAGGCTTCATCTGTG，下游引物（5'～3'）為GAACTCTGGGAATGTGCTGTT，Tm值為51.2℃，產(chǎn)物大小176 bp。β-actin上游引物（5'～3'）為CCTTGGTAGTGGATAATGGGTC，下游引物（5'～3'）為CATAACGCCCTGGTGTCG，Tm值為51.4℃，產(chǎn)物大小113 bp。反應(yīng)程序：95℃，10 min（95℃，15 s；60℃，45 s）× 30；95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s；60℃，15 s。

1.3.6 Western blot檢測培養(yǎng)后細(xì)胞Foxp3蛋白表達(dá)的檢測收集培養(yǎng)細(xì)胞，裂解提取細(xì)胞總蛋白，測量蛋白濃度。SDS-PAGE電泳約2 h；半干轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%BSA常溫?fù)u床封閉1 h，與Foxp3抗體4℃孵育過夜；TBST洗膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫孵育1 h；ECL化學(xué)發(fā)光檢測蛋白信號，置凝膠成像儀中曝光。

1.3.7 細(xì)胞懸液上清IL-10測定取培養(yǎng)后細(xì)胞4℃、3 000 r/min，離心10 min，收集上清，－80℃保存。上清液IL-10的測定采用ELISA法，檢測過程按操作說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TSLP可誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，提高CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞的比例

采用不同濃度（0.1、1、10、20 ng/mL）的TSLP作用于DC細(xì)胞24 h，離心后與前期分離的CD4+CD25－T細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)可使得部分反應(yīng)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞的比例明顯上調(diào)。PBS對照組的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞比例為（3.01±0.61）%，10 ng/mL TSLP組為（9.79±1.73）%，20 ng/mL TSLP組為（10.80±1.39）%，與PBS對照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0.1 ng/mL TSLP組為（3.00±0.56）%、1 ng/mL TSLP組為（3.01±0.52）%，與PBS對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

2.2 TSLP活化DC細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞Foxp3 mRNA表達(dá)

TSLP活化DC細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞的比例明顯上調(diào)，為證明上調(diào)的為CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，本研究使用RT-PCR法檢測上調(diào)的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞Foxp3 mRNA的表達(dá)水平。Foxp3 mRNA表達(dá)的半定量結(jié)果以Foxp3/β-actin吸光度的相對比值計(jì)算。PBS對照組細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)水平很低，相對定量為（1.31±0.02）；10 ng/mL TSLP組中Foxp3 mRNA表達(dá)相對量為（4.48±0.33），20 ng/mL TSLP組為（6.41±0.56），與PBS對照組相比有顯著性差異（P＜0.01）；0.1 ng/mL TSLP組和1 ng/mL TSLP組中Foxp3表達(dá)水平分別為（1.48±0.12）、（1.66±0.11），與PBS對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 TSLP活化DC細(xì)胞誘導(dǎo)CD4+CD25+T細(xì)胞Foxp3的蛋白表達(dá)

采用Western blot檢測上調(diào)的CD4+CD25+Foxp3Treg細(xì)胞Foxp3蛋白的表達(dá)，PBS對照組細(xì)胞中Foxp3蛋白的表達(dá)水平很低，相對定量為（0.290±0.006）；10 ng/mL TSLP組中Foxp3蛋白表達(dá)相對量為（0.610±0.003），20 ng/mL TSLP組為（0.680±0.002），與PBS對照組相比有顯著性差異（P＜0.01）；0.1 ng/mL TSLP組和1 ng/mL TSLP組中Foxp3蛋白表達(dá)水平分別為（0.330±0.006）、（0.390±0.003），與PBS對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

2.4 細(xì)胞懸液上清IL-10的ELSIA檢測

PBS對照組、0.1 ng/mL TSLP組、1 ng/mL TSLP組、10 ng/mL TSLP組、20 ng/mL TSLP組的IL-10水平分別為（21.11±5.87）、（21.92±4.62）、（22.67± 5.16）、（58.89±15.84）、（62.07± 15.75）pg/mL；與PBS對照組比較，10 ng/mL TSLP組、20 ng/mL TSLP組的IL-10顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1 ng/mL TSLP組、0.1 ng/mL TSLP組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。

圖1 各組CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞比例比較

圖2 各組Foxp3 mRNA的PCR擴(kuò)增（A)及分析（B）結(jié)果

圖3 各組Foxp3蛋白Western-blot（A）及分析（B）結(jié)果

3 討論

MG是一種免疫介導(dǎo)的影響神經(jīng)肌肉-接頭的T細(xì)胞依賴的自身免疫性疾病，胸腺作為細(xì)胞免疫起源地，其病理改變與MG發(fā)病之間的關(guān)系密不可分[6]。免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)胸腺T細(xì)胞的起源、發(fā)育及遷移與胸腺的微環(huán)境有相關(guān)性，在出現(xiàn)病理改變的胸腺組織中，胸腺微環(huán)境的變化對T細(xì)胞的增殖、分化影響明顯，在DC進(jìn)行抗原呈遞，存在針對AChR的自身反應(yīng)性T細(xì)胞以及相關(guān)B細(xì)胞分泌的抗AChR抗體[7]。正常胸腺可通過陰性選擇和陽性選擇去除對自身抗原有高親和力的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，也可以通過胸腺來源的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在外周組織中發(fā)揮抑制效應(yīng)即成為實(shí)現(xiàn)外周免疫耐受的重要途徑，而CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞主要在胸腺組織中產(chǎn)生，并遷移到外周血中，通過細(xì)胞接觸的方式分泌具有抑制功能的可溶性細(xì)胞因子，如IL-4、IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factors，TGF）-β等，能夠有效抑制CD4+自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖，維持正常外周耐受的穩(wěn)態(tài)[8]。其中Foxp3在Treg細(xì)胞發(fā)育分化過程中可誘導(dǎo)CD4+CD25－T細(xì)胞向CD4+CD25+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，在生物學(xué)結(jié)構(gòu)上也是Treg細(xì)胞能夠發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的必備條件[9]，當(dāng)Foxp3缺失時(shí)Treg細(xì)胞的免疫抑制功能會(huì)嚴(yán)重減弱。

TSLP是一種IL-7樣細(xì)胞因子，是DC的最特異和最強(qiáng)效的活化因子，此前曾有研究表明人TSLP在依賴CD11c+DC的情況下促進(jìn)CD4+CD25－胸腺細(xì)胞分化為CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，成功誘導(dǎo)CD4+CD25－胸腺細(xì)胞向Treg細(xì)胞方向分化[3]。這提示胸腺微環(huán)境下，TSLP以DC為中介，能夠有效地誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)和功能完備的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。有研究表明正常胸腺Hassall小體內(nèi)及周圍間質(zhì)有大量的TSLP表達(dá)，而MG患者胸腺發(fā)生增生和胸腺瘤改變，髓質(zhì)部結(jié)構(gòu)完整的Hassall小體數(shù)目減少，TSLP表達(dá)水平亦下降[4]。且DC散在分布于增生的細(xì)胞間，DC與TSLP相互聯(lián)系的空間結(jié)構(gòu)被破壞，TSLP表達(dá)不足加之缺少了DC的中介作用，影響到Treg細(xì)胞正常的發(fā)育過程，從而導(dǎo)致MG發(fā)生[10]。在自身免疫型糖尿病小鼠模型中通過重組TSLP誘導(dǎo)骨髓來源的DC，成功誘導(dǎo)天然T細(xì)胞向CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞分化，從而緩解糖尿病癥狀[11]。Lliev等[12]研究發(fā)現(xiàn)，腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生的TGF-β、RA、TSLP都參與致耐受DC的產(chǎn)生，在缺乏TSLP時(shí)，DC誘導(dǎo)Foxp3+Treg細(xì)胞分化的能力可由16.4%降至12.5%，補(bǔ)充外源性TSLP可使該功能恢復(fù)。

課題前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胸腺瘤及胸腺增生患者胸腺TSLP表達(dá)下降[4,10]，但TSLP能否誘導(dǎo)MG合并胸腺瘤患者Treg細(xì)胞產(chǎn)生，目前無相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明。本實(shí)驗(yàn)使用MG合并胸腺瘤患者的胸腺細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在增加外源性TSLP表達(dá)的情況下，通過活化DC后誘導(dǎo)CD4+CD25－胸腺細(xì)胞分化為CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，在較高濃度（10 ng/mL、20 ng/mL）的TSLP下，與對照組相比，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞/CD4+細(xì)胞的比例升高，F(xiàn)oxp3的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.05），提示在TSLP表達(dá)增加的情況下，MG合并胸腺瘤患者的胸腺細(xì)胞可通過DC的中介誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的分化成熟，為下一步探索分化成熟的Treg細(xì)胞免疫抑制功能及體外實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無力小鼠實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過對MG合并胸腺瘤患者的胸腺CD4+CD25－細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，在增加TSLP的情況下，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的數(shù)量及Foxp3的表達(dá)增加，但增加的CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的抑制功能，及對MG患者的肌無力癥狀有無改善，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

[1]賈建平.神經(jīng)病學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2013.

[2]Gradolatto A,Nazzal D,Truffault F,et al. Both Treg cells and Tconv cells are defective in the Myasthenia gravis thymus:Roles of IL-17 and TNF-α[J].J Autoimmun,2014,52:53-63.

[3]Watanabe N,Wang Y,Lee HK,et al.Hassall's corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+CD25+regulatory T cells in human thymus [J].Nature,2005,436:1181-1185.

[4]孫強(qiáng),歐陽靜萍,王云甫,等.胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素在重癥肌無力患者胸腺組織中的表達(dá)[J].鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,29:333-334, 338.

[5]孫延鵬,盧祖能,孫強(qiáng),等.重癥肌無力胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素表達(dá)與CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表型的研究[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2012,19: 439-443.

[6]中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)病學(xué)分會(huì)神經(jīng)免疫學(xué)組,中國免疫學(xué)會(huì)神經(jīng)免疫學(xué)分會(huì).中國重癥肌無力診斷和治療專家共識(shí)[J].中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志,2011,18:368-372.

[7]Weiss JM,Cufi P,Le Panse R,et al.The thymusinautoimmuneMyastheniaGravis: Paradigm for a tertiary lymphoid organ[J].Rev Neurol,2013,169:640-649.

[8]Cavalcante P,Le PR,Berrih-Aknin S,et al. The thymus in myasthenia gravis:Site of"innate autoimmunity"[J].Muscle Nerve,2011,44: 447-484.

[9]Sakaguchi S,Wing K,Yamaguchi T,et al. Dynamics of peripheral tolerance and immune regulation mediated by Treg[J].Eur J Immunol, 2009,39:2331-2336．

[10]Buckner JH,Ziegler SF.Functional analysis of Foxp3[J].Ann N Y Acad Sei,2008,11: 151-169.

[11]Besin G,Gaudreau S,Ménard M,et al. Thymic stromal lymphopoietin and thymic stromal lymphopoietin-'conditioned dendritic ceils induceregulatoryT-celldifferentiationand protection of NOD mice against diabetes[J]. Diabetes,2008,57:2107-2117.

[12]Lliev ID,Spadoni I,Mileli E,et al.Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells[J].Gut,2009, 58:1481-1489.

（本文編輯：王晶）

Differentiation of Intrathymic CD4+CD25－T Cells to CD4+CD25+Foxp3+Regulatory T Cells Induced by Thymic Stromal Lymphopoietin in Myasthenia Gravis Patients

LU Zu-neng,YUAN-Jiang,ZHANG Yue-liang,WANG Yun-fu.Department of Neurology,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective:To investigate the effect of thymic stromal lymphopoietin(TSLP)on the differentiation of intrathymic CD4+CD25－T cells to CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in myasthenia gravis(MG)patients with abnormal thymus gland.Methods:Intrathymic CD4+CD25－T cells and dendritic cells isolated by immunomagnetic beads on MiniMACS device were co-cultured with different concentrations of TSLP(0.1,1,10,20 ng/mL)for 7 days.The ratio of CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T cells was tested by flow cytometry.The expression of Foxp3 mRNA and protein was measured by RT-PCR and Western blot respectively.The concentration of serum IL-10 was detected by ELISA.Results:The ratio of CD4+CD25+Foxp3+Treg/CD4+T cell,the expression of Foxp3 mRNA and protein,and the level of IL-10 was increased significantly in groups with 10 ng/mL and 20 ng/mL TSLP compared with those in the PBS control group(P＜0.05).Conclusion:TSLP may induce the differentiation of intrathymic CD4+CD25－T cells to CD4+CD25+Foxp3+regulatory T cells in MG patients with abnormal thymus gland and up-regulate the expression of Foxp3.

myasthenia gravis;thymic stromal lymphopoietin;regulatory T cells

R741;R746.1

ADOI10.3870/sjsscj.2015.02.013

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科
武漢430060
2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科
湖北十堰442000

湖北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目

（No.D20112102）；湖北省科技廳自然科學(xué)基金

（No.2010CDB091 03）

2014-11-06

王云甫

wyfymc@163.com