戚月鳳，湯繼宏，李巖，顧琴

GABAA受體γ2亞單位在海人酸顳葉癲癇大鼠海馬內(nèi)的表達(dá)

戚月鳳1，湯繼宏2，李巖2，顧琴2

目的：探討癲癇發(fā)作后GABAA受體γ2亞單位在海馬各區(qū)的動(dòng)態(tài)表達(dá)以及氯硝西泮干預(yù)對(duì)其表達(dá)的影響。方法：健康成年雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為對(duì)照組5只，致癇組15只，干預(yù)組15只，干預(yù)對(duì)照組5只。大鼠海馬CA3區(qū)注射海人酸建立顳葉癲癇模型，干預(yù)組大鼠在致癇前予以氯硝西泮灌胃。于致癇后6 h、12 h和1 d采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)γ-氨基丁酸A受體γ2亞單位（GABAARγ2）的動(dòng)態(tài)表達(dá)水平。結(jié)果：致癇組在海人酸給藥后6 h、12 h及1 d，海馬CA3區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；CA1區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)也下降，注射后1 d顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。干預(yù)組在海人酸注射后1 d CA1和CA3區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.05）；海人酸注射后6 h、12 h及1 d，CA3區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)均高于同時(shí)間點(diǎn)致癇組（P＜0.05），CA1區(qū)于海人酸注射后1 d，GABAARγ2蛋白表達(dá)顯著高于同時(shí)間點(diǎn)致癇組（P＜0.01）。結(jié)論：海人酸誘導(dǎo)的顳葉癲癇模型中，海馬GABAARγ2蛋白表達(dá)減少，氯硝西泮可緩解顳葉癲癇導(dǎo)致的GABAARγ2蛋白表達(dá)減少。

顳葉癲癇；GABAA受體；γ2亞單位；海人酸；海馬

顳葉癲癇是常見(jiàn)且治療較棘手的局灶性癲癇，約占難治性部分性癲癇的70%[1]。其病因復(fù)雜，臨床研究其病因及致癇機(jī)制困難，經(jīng)實(shí)驗(yàn)性顳葉癲癇模型加以研究是主要而有效途徑。本研究通過(guò)大鼠海馬CA3區(qū)注射海人酸建立模擬人類復(fù)雜部分發(fā)作的顳葉癲癇動(dòng)物模型[2,3]，以γ-氨基丁酸A受體γ2亞單位（A-type receptor of γ-aminobutynic acid γ2 subunit，GABAARγ2）為研究對(duì)象，觀察其在致癇大鼠海馬各區(qū)不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)表達(dá)及地西泮干預(yù)對(duì)其影響，以了解該受體亞單位在癲癇發(fā)作中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年雄性SD大鼠40只，由蘇州大學(xué)動(dòng)物中心提供。大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組5只，致癇組15只，干預(yù)組15只，干預(yù)對(duì)照組5只。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑海人酸購(gòu)于Sigma公司，兔抗GABAARγ2多克隆抗體購(gòu)于吉泰生物科技有限公司，免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 建立顳葉癲癇動(dòng)物模型致癇組大鼠用10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后俯臥位固定于立體定向儀，按照大鼠腦立體定向圖譜[4]確定海馬CA3區(qū)給藥點(diǎn)的三維坐標(biāo)，微量注射器注入0.4 μg/μL海人酸（4 μg/kg）。對(duì)照組大鼠以相同方法注射等量生理鹽水。干預(yù)組大鼠在致癇前予以氯硝西泮（6 mg/kg·d）灌胃，2次/日，連續(xù)5 d，然后采用與致癇組相同方式致癇。干預(yù)對(duì)照組給予2 mL生理鹽水灌胃，其他與干預(yù)組相同。術(shù)畢將大鼠放回籠中，觀察其行為改變，2次/日。驚厥發(fā)作程度按Racine[5]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)任何發(fā)作跡象；Ⅰ級(jí)：面肌抽搐包括凝視、節(jié)律性咀嚼、眨眼、立須、濕狗樣顫動(dòng)等；Ⅱ級(jí)：頸肌抽搐，節(jié)律性點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)為主；Ⅲ級(jí)：?jiǎn)蝹?cè)前肢抽搐；Ⅳ級(jí)：雙側(cè)前肢陣攣、抽搐伴身體立起；Ⅴ級(jí)：雙側(cè)后肢強(qiáng)直，身體背曲強(qiáng)直，跌倒伴全身陣攣。Racine分級(jí)在3～4級(jí)以上鼠為模型成功，納入研究。

1.2.2 HE染色觀察海馬病理學(xué)改變及免疫組化法測(cè)定海馬GABAARγ2表達(dá)于致癇后6 h、12 h和1 d灌注固定和取腦，各時(shí)間點(diǎn)5只。石蠟包埋，于海馬部位連續(xù)冠狀切片，片厚4 μm，切片隔4張取1張，行HE染色，相鄰切片行GABAARγ2免疫組織化學(xué)染色。以兔抗GABAARγ2免疫組化多克隆抗體為一抗，按試劑盒說(shuō)明采用SABC法行免疫組化染色，DAB著色，陽(yáng)性著色為棕黃色，對(duì)照實(shí)驗(yàn)以PBS代替一抗。用圖像采集分析軟件（Image-Pro-Plus）計(jì)算出GABAARγ2亞單位在相同放大倍數(shù)（×400）顯微圖片中海馬各區(qū)的陽(yáng)性染色面積百分比，各區(qū)取平均數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 海馬病理改變

致癇組大鼠在海人酸注射后6 h即可見(jiàn)其注射側(cè)海馬神經(jīng)元受到損害，以CA3區(qū)最明顯，正常細(xì)胞明顯減少；可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞腫脹、排列不整齊、稀疏，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞體突起明顯減少，細(xì)胞輪廓不清，胞核異位，核仁模糊；壞死的神經(jīng)元胞漿濃縮、深染，核碎裂；星形膠質(zhì)細(xì)胞體積增大，胞漿淡染；齒狀回顆粒細(xì)胞部分受損，其胞核固縮，細(xì)胞排列雜亂。海人酸注射對(duì)側(cè)的海馬結(jié)構(gòu)亦受破壞，但受損程度明顯輕于對(duì)側(cè)。干預(yù)組大鼠海馬神經(jīng)元受損較致癇組較輕。

2.2 各組大鼠海馬各區(qū)GABAARγ2的表達(dá)

各組大鼠海馬CA1及CA3區(qū)均出現(xiàn)GABAARγ2蛋白免疫陽(yáng)性細(xì)胞，胞體和胞漿呈棕黃色，周圍有放射狀突起，胞核未著色。致癇組在海人酸給藥后6 h、12 h及1 d，海馬CA3區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)均顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）；CA1區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)也下降，注射后1 d顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。對(duì)照組與干預(yù)組GABAARγ2蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)組在海人酸注射后1 d CA1和CA3區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.05）；海人酸注射后6 h、12 h及1 d，CA3區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)均高同時(shí)間點(diǎn)致癇組（P＜0.05），CA1區(qū)于海人酸注射后1 d，GABAARγ2蛋白表達(dá)顯著高于同時(shí)間點(diǎn)致癇組（P＜0.01）。見(jiàn)圖1、表1。

3 討論

癲癇發(fā)作損傷神經(jīng)細(xì)胞，海馬神經(jīng)元的損傷和脫失在癲癇（尤其是顳葉癲癇）的發(fā)生中起著關(guān)鍵性作用，兩者互為因果[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，一側(cè)海馬CA3區(qū)注射海人酸，雙側(cè)海馬均可出現(xiàn)神經(jīng)元變性。目前認(rèn)為，注射側(cè)神經(jīng)元損害可能是海人酸的直接興奮毒性作用，海人酸受體為離子型谷氨酸受體，在海馬CA3區(qū)特異性高親和力受體最多，因此該區(qū)最容易出現(xiàn)神經(jīng)元過(guò)度興奮而致神經(jīng)元死亡。而對(duì)側(cè)則可能是由傳入興奮性通路的過(guò)度興奮造成，與癲癇放電的突觸傳播及腦組織的血流/氧耗比下降所引起的缺血-缺氧有關(guān)。本研究還觀察到，在海馬神經(jīng)元缺失的區(qū)域可見(jiàn)膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生，形成膠質(zhì)團(tuán)塊，與人類顳葉癲癇的海馬硬化極為相似（數(shù)據(jù)未提供）。因此，一側(cè)海馬注射海人酸所造成的病理?yè)p害類似于人類顳葉癲癇，并可能是造成慢性反復(fù)性自發(fā)發(fā)作的主要基礎(chǔ)。

圖1 各組海馬CA3區(qū)GABAARγ2蛋白免疫組化檢測(cè)結(jié)果（光學(xué)顯微鏡，×400）

表1 各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)比較

表1 各組大鼠海馬CA1和CA3區(qū)GABAARγ2蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，①P＜0.01，②P＜0.05；與同時(shí)間點(diǎn)致癇組比較，③P＜0.01，④P＜0.05

?

癲癇的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，但最后通路是興奮性和抑制性不平衡導(dǎo)致大腦神經(jīng)元異常放電。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)最重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在中間神經(jīng)元內(nèi)合成和分泌，在慢性癲癇中癲癇發(fā)作引發(fā)選擇性的中間神經(jīng)元凋亡和壞死，可導(dǎo)致GABA抑制性作用不足，進(jìn)而導(dǎo)致癲癇反復(fù)發(fā)作[7]。GABA受體亞型主要有GABAA和GABAB。GABAAR與癲癇關(guān)系最密切，其是由鑲嵌在神經(jīng)細(xì)胞膜雙層脂質(zhì)中的2α、2β、1γ 5個(gè)亞基組成的五邊形異質(zhì)多肽寡聚體大分子[8,9]。在成熟腦中GABAARα1與γ2亞單位的組合廣泛表達(dá)，數(shù)量最多，而且α1和γ2亞單位是苯二氮卓類藥物的抗癇作用位點(diǎn)，該2種亞單位的異?？僧a(chǎn)生快速的苯二氮卓類藥物抵抗，有重要的臨床意義。

關(guān)于亞單位α1與癲癇關(guān)系的研究國(guó)內(nèi)外亦已有多篇報(bào)道[10-12]，關(guān)于亞單位γ2的研究較少。本文通過(guò)海人酸大鼠模型研究癲癇發(fā)作后GABAARγ2亞單位的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在CA1和CA3的錐體細(xì)胞層內(nèi)，γ2亞單位免疫反應(yīng)性在急性期（6～24 h）均下降，這與CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體細(xì)胞層的損傷相一致，說(shuō)明CA1區(qū)和CA3區(qū)錐體細(xì)胞層的損傷導(dǎo)致了γ2亞單位在該區(qū)域內(nèi)蛋白水平的下降，提示在該區(qū)域內(nèi)GABA能傳遞的缺損。本研究結(jié)果與Tsunashima和Schwarzer等[14,15]等通過(guò)原位雜交研究的海人酸誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)作后GABAARγ2亞單位mRNA在急性期海馬中的表達(dá)基本一致。不僅GABAARγ2亞單位表達(dá)異常與癲癇發(fā)作有關(guān)，GABAAR亞單位γ2多種突變（K289M、R43Q、Q351、R139、W390X等）亦與癲癇發(fā)作密切相關(guān)[16-19]。GABAARγ2表達(dá)在海馬各區(qū)的減少可能是顳葉癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元缺失所致，但GABAARγ2表達(dá)減少可能導(dǎo)致癲癇的進(jìn)一步發(fā)展，隨時(shí)間推移海馬區(qū)殘存的錐體細(xì)胞GABAARγ2表達(dá)有增加趨勢(shì)（數(shù)據(jù)未提供），此可能為顳葉癲癇的內(nèi)源性自我保護(hù)機(jī)制，通過(guò)表達(dá)增多，加強(qiáng)抑制作用，更好地防止癲癇反復(fù)發(fā)作。

氯硝西泮是目前臨床上用于治療急性癲癇發(fā)作的最常用藥物，為苯二氮卓受體完全激動(dòng)劑。氯硝西泮對(duì)癲癇發(fā)作后神經(jīng)元的保護(hù)作用與神經(jīng)元GABA受體上苯二氮卓位點(diǎn)的激活有關(guān)?，F(xiàn)認(rèn)為苯二氮卓類的作用位點(diǎn)在α和γ亞單位上，γ2亞單位的存在有利于苯二氮卓的正性調(diào)節(jié)作用[20-22]。地西泮通過(guò)作用于α1和γ2亞單位增強(qiáng)GABA與其受體的作用,有利于神經(jīng)元產(chǎn)生抑制性突觸后電位，使癲癇發(fā)作后缺血神經(jīng)元的興奮性降低和損傷程度減輕，該2種亞單位的異?？僧a(chǎn)生快速的苯二氮卓類藥物抵抗。本研究結(jié)果表明，氯硝西泮可增強(qiáng)癲癇急性期海馬GABAARγ2表達(dá)水平，能減輕海人酸所致的早期神經(jīng)元損傷，對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)性作用。

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（本文編輯：唐穎馨）

Expression of GABAA Receptor γ2 Subunit in Hippocampus of Rats with KA-induced TemporalLobe Epilepsy

QI Yue-feng,TANG Ji-hong,LI Yan,GU Qin.Department of pediatrics,Shandong Jining No.1 People’s Hospital,Shandong 272002,China

Objective:To study the expression of GABAA receptor γ2 subunit(GABAARγ2)protein in hippocampus of rats with KA-induced temporal lobe epilepsy.To investigate the effect of clonazepam(CZP)administration on expression of GABAARγ2.Methods:Forty male SD rats were randomly divided into control group(n=5), epilepsy group(n=15),intervention group(n=15),and intervention control group(n=5).Temporal lobe epilepsy model was established by injecting kainic acid into CA3 region of the hippocampus in rats in both the epilepsy and intervention groups.Rats in the intervention group were treated with CZP.The expression of GABAARγ2 protein was investigated by immunohistochemistry at 6 h,12 h and 1 d after operation respectively.Results:The expression of GABAARγ2 protein in CA3 of the rats in the epilepsy group was significantly lower than that in the control group(P＜0.01)at 6 h,12 h and 1 d after operation and the expression of GABAARγ2 protein in CA1 region was significantly lower than that in the control group(P＜0.01)only at 1 d after operation.The expression of GABAARγ2 protein in both CA3 and CA1 regions in the intervention group were lower than that in the control group(P＜0.05).The expression of GABAARγ2 protein in CA3 region was significantly higher than that in the epilepsy group at 6 h,12 h and 1 d after operation(P＜0.05)and the expression of GABAARγ2 protein in CA1 was significantly higher than that in the epilepsy group(P＜0.01)only at 1 d after operation.Conclusion:The expression of GABAARγ2 protein was decreased in hippocampus of temporal lobe epilepsy model rats,and CZP could relieve the decrease of GABAARγ2 protein.

temporal lobe epilepsy;GABAA receptor;γ2 subunit;kainic acid;hippocampus

R741；R742.1

ADOI10.3870/sjsscj.2015.02.005

1.山東濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院兒科
山東濟(jì)寧272002 2.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院神經(jīng)科
江蘇蘇州215003

江蘇省自然科學(xué)基金

（No.BK2011309）

2014-12-10

湯繼宏

tjhzsh@126.com