馬俊芳，崔博，沈東超，崔麗英,2

CyclinD1基因過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建和對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

馬俊芳1,3，崔博1，沈東超1，崔麗英1,2

目的：針對小鼠cyclinD1基因構(gòu)建質(zhì)粒并進(jìn)行慢病毒包裝，轉(zhuǎn)染小鼠神經(jīng)干細(xì)胞，檢測其表達(dá)水平。方法：根據(jù)cyclinD1基因信息，采用DNA重組技術(shù)將Nestin promoter-Ccnd1基因插入plenti6慢病毒表達(dá)載體，重組獲得慢病毒載體plenti-D1；經(jīng)測序鑒定后，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞生產(chǎn)病毒液，并檢測病毒滴度。設(shè)立空白對照組、陰性病毒對照組及過表達(dá)慢病毒感染組。將病毒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)實(shí)時熒光定量PCR和western blot法分析轉(zhuǎn)染前后3組cyclinD1表達(dá)情況，MTT法檢測不同MOI值對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：測序結(jié)果證實(shí)cyclinD1基因正確插入載體中，成功構(gòu)建小鼠cyclinD1基因過表達(dá)載體。實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果顯示過表達(dá)慢病毒感染組cyclinD1 mRNA較其他2組明顯升高；Western Blot鑒定cyclinD1蛋白表達(dá)成功。plenti-D1的MOI值為10、20、50時均明顯促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖。結(jié)論：cyclinD1基因慢病毒表達(dá)載體能感染小鼠胚胎神經(jīng)干細(xì)胞，外源基因穩(wěn)定表達(dá)。cyclinD1基因過表達(dá)能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

cyclinD1；過表達(dá)；神經(jīng)干細(xì)胞；細(xì)胞周期

Cyclin D1是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，通過與CDK4或CDK6形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)細(xì)胞向S期的轉(zhuǎn)變。cyclinD1有獨(dú)立于CDK的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄功能[1]，cyclinD1在許多神經(jīng)分化模型中都表達(dá)增高[2]，但具體作用不清。筆者前期研究顯示，cyclinD基因敲除對神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化沒有明顯影響，但顯著抑制了其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化[3]。本研究擬構(gòu)建由神經(jīng)干細(xì)胞的特異性啟動子--Nestin驅(qū)動的cyclin D1重組慢病毒，探討cyclin D1基因轉(zhuǎn)染對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物出生24 h的C57BL/6小鼠購自維通利華。

1.1.2 試劑胎牛血清、Neurobasal培養(yǎng)液、B27無血清添加劑、DMEM培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)液，均購自Gibco公司；表皮生長因子（epiderinal growth factor，EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）均購自Peprotech公司；四甲基噻唑蘭（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）購自sigma公司；慢病毒質(zhì)粒pLenti6、包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG（Life）均購自Invitrogen公司；DNA純化試劑盒購自Axygen公司。引物由上海生工公司合成。鼠抗cyclinD1抗體購自sigma公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體購自中杉公司。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代原代培養(yǎng)：出生24 h內(nèi)的C57BL/6小鼠，無菌法取腦，剔除腦膜和血管，取海馬和室管膜下區(qū)腦組織，加入無血清培養(yǎng)液，吹打至混濁，1 000 rpm離心5 min后去上清，加入無血清培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。按106個/mL密度接種于培養(yǎng)瓶，37℃，飽和濕度，5%CO2，95%空氣（所有細(xì)胞培養(yǎng)條件與此相同）飽和培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第2天見小神經(jīng)球形成，球體積逐漸增大，以后每3天半量換液，神經(jīng)球變大后每7天傳代1次。傳代培養(yǎng)：將含有較大神經(jīng)球的細(xì)胞懸液吸取置于無菌離心管中；1 000 rpm離心5 min，棄掉大部分舊培養(yǎng)基，輕輕吹打至細(xì)胞懸液變混濁，加入無血清培養(yǎng)液，分置2個培養(yǎng)瓶中，調(diào)整密度為105～106個/mL，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 針對小鼠cyclinD1的過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建根據(jù)Nestin promoter-Ccnd1的基因信息，通過化學(xué)合成的oligo以PCR的方法拼接成所需的序列。將目的序列（Nestin promoter-Ccnd1）與IRES2-EGFP融合后與pDONR221載體進(jìn)行BP重組得到入門載體，然后將入門載體與和慢病毒表達(dá)的目的載體pLenti6/BLOCK_iT-DEST進(jìn)行LR重組反應(yīng)，以獲得目的片斷的高表達(dá)慢病毒表達(dá)載體。根據(jù)Nestin promoter-Ccnd1和IRES2-EGFP序列設(shè)計(jì)合成PCR引物，Nestin上游引物5’端加ATTB1重組臂序列，EGFP下游引物5’端加ATTB2重組臂序列，引物序列如下：Ccnd1上游引物：5-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATCCTCCGCTTCCG-3，Ccnd1下游引物：5-ACCGGCCTTATTCCAAGCGGCTTCGGCCAGTAACGTTAGG-3，A T T B 2-E G F P：5-G GGG ACCA CTTTGT ACAAGA AAGCTGG GTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTG-3，IRES2-1F：5-GCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAAC-3，Nestin promoter-R：5-CCCTTGCTCACCATGGTGGCGGGTCAGGTAGGCCTCCAGGCGTCG-3，EGFP-F：5-ACGCCTGGAGGCCTACCTGACCCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3。

1.2.3 慢病毒的包裝培養(yǎng)293T細(xì)胞株作為包裝細(xì)胞，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下將2 μg plenti6重組質(zhì)粒與10 μg慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔镛D(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染36 h和48 h后收集上清液，將含有慢病毒顆粒的上清離心，并用孔徑為0.45 μm的PVDF濾膜過濾，超速離心，將待測的各病毒儲藏液按梯度稀釋分組后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，結(jié)合PCR測定病毒滴度。

1.2.4 慢病毒載體的有效性驗(yàn)證培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞至匯合度70%～75%時，行慢病毒感染。分為空白對照組、陰性病毒對照組和過表達(dá)慢病毒感染組；慢病毒感染細(xì)胞后24 h離心，去病毒液，加入正常培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h收集細(xì)胞RNA和總蛋白，PCR和Western Blot分別檢測mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.2.5 RNA提取和PCR按RNA-Trizol試劑盒操作指南提取RNA。熒光定量PCR檢測所用引物序列：CCND1上游引物為：ACCATTCCCTTGACTGCCGA，下游引物為：GGAGGGTGGGTTGGAAATGA；β-actin上游引物為：GTGACGTTGACATCCGTAAAGA，下游引物為：GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC。PCR反應(yīng)條件：95℃，10 min；40個PCR循環(huán)：95℃，15 s；60℃，15 s；60℃，60 s；末段延伸：60℃，5 min。為了建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從75℃緩慢加熱到95℃，每20 s升高l℃后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)終產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶大小和豐度。

1.2.6 Western Blot將神經(jīng)干細(xì)胞吸去培養(yǎng)基后，用PBS洗1遍，常規(guī)提取總蛋白，用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行蛋白電泳再經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育，ECL底物在暗室中曝光膠片，保存數(shù)據(jù)。掃描照片用軟件Image·Quant 5.0進(jìn)行分析，以光密度值表示各組的蛋白相對表達(dá)量，其中空白細(xì)胞組的光密度值作為對照。

1.2.7 MTT比色法將神經(jīng)干細(xì)胞機(jī)械吹打后按2×104個/cm2的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，在37℃，5% CO2環(huán)境下，3組在鏡下觀察細(xì)胞加入MOI值分別為0、5、10、20、50、100的病毒24 h后，離心去除病毒，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h后做MTT檢測。MTT比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在96孔培養(yǎng)板中按等比遞增的順序，定量加入正常（37℃，5% CO2）條件下的神經(jīng)干細(xì)胞，按MTT比色法處理后，測定AOD值。以細(xì)胞數(shù)為橫坐標(biāo)，AOD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。MTT比色法測定細(xì)胞活性：在各組終止培養(yǎng)后的96孔培養(yǎng)板中，每孔吸出上清液10 μL，再加入5 mg/mL MTT 10 μL。孵育4 h，小心吸去上清液100 μL，然后加入20%SDS/50%DMF100 μL。孵育6 h后，在Elx800酶標(biāo)儀上測AOD值。測定波長570 nm，參考波長630 nm。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 慢病毒質(zhì)粒載體的鑒定結(jié)果

Plenti-D1慢病毒質(zhì)粒載體測序結(jié)果表明，重組慢病毒質(zhì)粒載體的插入序列與設(shè)計(jì)序列一致，沒有堿基缺失或替換等，證明慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功，見圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染cyclinD1細(xì)胞鏡下結(jié)果

Plenti6載體中帶有GFP標(biāo)記基因，重組慢病毒plenti-D1轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞后綠色熒光強(qiáng)度高，細(xì)胞生長良好，轉(zhuǎn)染后過表達(dá)慢病毒感染組的大部分細(xì)胞均有GFP表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率較高，見圖2。

2.3 過表達(dá)慢病毒感染組神經(jīng)干細(xì)胞的ccnd1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)

空白對照組和陰性病毒對照組低表達(dá)cyclinD1基因，過表達(dá)慢病毒感染組cyclinD1表達(dá)水平明顯增高，表明cyclinD1慢病毒載體感染可使神經(jīng)干細(xì)胞顯著表達(dá)ccnd1的mRNA，見圖3。

2.4 過表達(dá)慢病毒感染組神經(jīng)干細(xì)胞的cyclinD1蛋白表達(dá)增加

Western blot檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)慢病毒感染組較其它2組有更強(qiáng)的cyclinD1的蛋白表達(dá)，見圖4。

2.5 不同MOI值的病毒對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，MOI值分別為10、20及50時，過表達(dá)慢病毒感染組的OD值比其他2組顯著增高（P＜0.01），說明神經(jīng)干細(xì)胞明顯增殖；在MOI值為100時，過表達(dá)慢病毒感染組OD值顯著低于空白對照組（P＜0.01），說明加入神經(jīng)干細(xì)胞增殖受到抑制，考慮為病毒毒性作用。過表達(dá)慢病毒感染組內(nèi)，MOI值為20時OD值較MOI值為10時的OD值增高（P＜0.05），MOI值為50時的OD值與MOI值20時的OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見圖5。

3 討論

由于神經(jīng)系統(tǒng)及神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)染的特殊性和難度，本研究選用了慢病毒的經(jīng)典方法，為了能在神經(jīng)干細(xì)胞中特異性的表達(dá)，選擇Nestin作為啟動子，構(gòu)建了小鼠cyclinD1基因的過表達(dá)慢病毒載體，并包裝成為慢病毒顆粒，通過RNA水平和蛋白質(zhì)水平的雙重檢測，確認(rèn)了基因研究工具的有效性。慢病毒載體的主要優(yōu)點(diǎn)是它能將外源基因整合入非分裂細(xì)胞的基因組內(nèi)，對停止分裂的神經(jīng)元轉(zhuǎn)基因治療提供了一個可行的基因傳遞系統(tǒng)[4,5]。在此基礎(chǔ)上，利用慢病毒載體plenti6系統(tǒng)制備了小鼠cyclinD1基因的過表達(dá)慢病毒顆粒，并在體外神經(jīng)干細(xì)胞中檢測了它們上調(diào)基因表達(dá)水平的有效性。結(jié)果可見，在神經(jīng)干細(xì)胞中，慢病毒顆?？捎行П磉_(dá)完整全長且大小正確的小鼠cyclinD1蛋白，證明了工具的有效性。

圖1 載體圖譜

圖2 GFP標(biāo)記的重組慢病毒plenti-D1轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞

圖3 各組神經(jīng)干細(xì)胞ccnd1 mRNA的表達(dá)

圖4 各組神經(jīng)干細(xì)胞cyclinD1蛋白的表達(dá)

圖5 不同MOI值的病毒對各組神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響

Cyclin D1是由CCNDI基因編碼，全長120 kbp，主要分布在細(xì)胞核和胞質(zhì)中，是重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白[6]。在G1后期，cyclinD1已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在許多神經(jīng)分化模型中都表達(dá)增高。通過cyclin D1基因敲除鼠，Ma等[3]發(fā)現(xiàn)cyclinD1基因敲除對神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化沒有明顯影響，但顯著抑制了其向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。Lange等[7]也發(fā)現(xiàn)CDK4/cyclinD1的過度表達(dá)能夠抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。

神經(jīng)干細(xì)胞具有持續(xù)自我更新和多向分化潛能，能分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等多種神經(jīng)組織細(xì)胞，而且具有遷移功能和良好的組織融合性和低免疫源性，使其在神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)和神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的細(xì)胞替代治療及基因治療中有著巨大的應(yīng)用價值。但要應(yīng)用于臨床，還有許多問題待解決。神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和定向分化就是關(guān)鍵性的問題，其受內(nèi)外源性因素共同影響，如堿性螺旋-環(huán)-螺旋基因、Notch信號、細(xì)胞因子、微環(huán)境及化學(xué)誘導(dǎo)劑等均起作用[8,9]。本研究發(fā)現(xiàn)，cyclinD1基因過表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。

本研究以慢病毒載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建帶有小鼠cyclinD1基因的重組慢病毒質(zhì)粒plenti-D1，經(jīng)過包裝、擴(kuò)增得到高滴度的病毒顆粒。體外轉(zhuǎn)染第二代神經(jīng)干細(xì)胞，在基因和蛋白質(zhì)水平均檢測到cyclinD1表達(dá)明顯增加，說明cyclinD1特異性的轉(zhuǎn)染成功并且在神經(jīng)干細(xì)胞中高表達(dá)。在本研究中，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)cyclinD1基因過表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)為后期cyclinD1基因在神經(jīng)干細(xì)胞的分化條件研究中奠定基礎(chǔ)。

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（本文編輯：唐穎馨）

Construction of CyclinD1 Gene Overexpression Lentivirus Vector and Its Effect on theProliferation of Neural Stem Cells

MA Jun-fang,
CUI Bo,SHEN Dong-chao,CUI Li-ying.Department of Neurology,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Science&Peking Union Medical College,Beijing 100730,China

Objective:In order to study the effect of cyclinD1 on neural stem cell proliferation,the cyclinD1 gene overexpression lentiviral vector was constructed and the expression of cyclinD1 in neural stem cells in mice after transfection was tested.Methods:Nestin promoter-Ccnd1 gene was inserted into plenti6 lentiviral expression vectors by DNA recombination technique.Lentiviral vector plenti-D1 was established after recombination.Recombinant lentiviral vector was detected by DNA sequencing.The plenti-D1 was transfected into 293T cell line.The viruses yielded by 293T cell were transfected into mouse embryonic neural stem cells.The expression of cyclinD1 was detected by real-time PCR and Western Blot analysis after transfection.We studied the effects of different MOI values of plenti-D1 on neural stem cell proliferation by MTT assay.Results:It was confirmed by DNA sequencing that the cyclinD1 gene sequencing was correctly inserted into the vector,and that the cyclinD1 gene overexpression lentiviral vector was successfully constructed.After extracting the infected cells,the real-time PCR showed cyclinD1 mRNA overexpression was significantly higher than the control groups;Western Blot analysis was used to detect expression of cyclinD1 protein in neural stem cells.The cyclinD1 gene overexpression lentiviral vector was significantly up-regulated in mRNA level or in protein level in neural stem cells.When the MOI was 10,20,and 50,the viruses significantly promoted the proliferation of neural stem cells.Conclusion:The cyclinD1 gene overexpression lentiviral vector was successfully constructed and it efficiently up-regulated the expression of cyclinD1 in mouse embryonic neural stem cells.CyclinD1 overexpression can promote the proliferation of neural stem cells.

cyclinD1;over expression;neural stem cell;cell cycle

R741；R741.02

ADOI10.3870/sjsscj.2015.02.002

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科
北京100730
2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)中心
北京100730
3.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科
合肥230001

國家自然科學(xué)基金青年基金

（No.81100876）；中國博管會基金面上項(xiàng)目

（No.2014M56091 0）；

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院院校博士后基金

2015-02-26

崔麗英

pumchcuily@sina. com