周黎 趙穎 王玉 李麗波 張樹軍 李濤

在現(xiàn)代抗腫瘤藥物中，中藥占據(jù)重要的地位，目前從中草藥資源中尋找選擇性高、活性強(qiáng)、作用獨(dú)特、毒副作用小的抗腫瘤新藥研究方興未艾[1]。中華苦荬菜又名絲葉苦菜、山苦菜，系菊科被子植物，1~2年生或多年生草本，葉或莖被折斷后有白色乳狀物流出，全草呈苦味，具有清熱、解毒、消炎、涼血、止痛、消腫等功效[2-3]。本研究首次報(bào)道了中藥中華苦荬菜根部提取物Chinensiolide A（化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1）在細(xì)胞水平上對肺腺癌A549細(xì)胞、人肝癌Ble-7402細(xì)胞、結(jié)直腸腺癌LoVo三種細(xì)胞的抑制作用，為該藥接下來的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

圖1 Chinensiolide A化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 中華苦荬菜提取物Chinensiolide A由張樹軍等[4]合成，純度≥98%（HPLC），人肺腺癌A549細(xì)胞、肝癌Ble-7402細(xì)胞及結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞來自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)研究室[5-6]。DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自hyclone公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑鹽（MTT）及二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備 Safire2多功能酶標(biāo)儀購自奧地利，潔凈操作臺購自蘇凈集團(tuán)安泰公司，二氧化碳孵箱購自日本三洋公司，Olympus IX70-SIF2倒置顯微鏡；恒溫水浴鍋，電子天平購自德國賽多利斯集團(tuán)，微量移液器購自Gilson公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥液配制 精密稱取Chinensiolide A 粉末適量，轉(zhuǎn)至1 mL量瓶中，加入DMSO稀釋至刻度，充分溶解，使母液濃度為55 mmol/L。取母液10 μL，加入不含血清的培養(yǎng)基990 μL，稀釋至550 μmol/L的工作液。過濾除菌后使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。取上述工作液10 μL，加至100 μL細(xì)胞液中，終濃度為50 μmol/L，確保DMSO的終濃度不超過0.1%。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將肺腺癌A549細(xì)胞、肝癌Ble-7402細(xì)胞及結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞分別置于5 mL DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長，復(fù)蘇次日及隔日更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞至對數(shù)生長期進(jìn)行傳代，消化液為0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA[7]。實(shí)驗(yàn)選擇處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行研究。

1.3.3 MTT法測細(xì)胞活性 對數(shù)生長期的A549細(xì)胞、Ble-7402細(xì)胞及LoVo細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)制成細(xì)胞懸液，濃度為4×104個/mL，取100 μL接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的Chinensiolide A，加樣體積為10 μL/孔，對照孔加DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后每孔加入6 mg/mL的MTT磷酸緩沖液10 μL，同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)原有液體，加DMSO 150 μL/孔，振蕩以充分溶解結(jié)晶，用全自動酶標(biāo)儀測定570 nm處的吸光度（D值）（參比波長630 nm）。以溶劑對照組細(xì)胞存活率為100%，計(jì)算不同濃度的Chinensiolide A實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的存活率和抑制率。計(jì)算公式如下：存活率=（Chinensiolide A 實(shí)驗(yàn)組D值/對照組D值）×100%；抑制率=100%-存活率。采用計(jì)算軟件（LOGIT 法）計(jì)算Chinensiolide A的半數(shù)抑制濃度（IC50）值，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.4 形態(tài)學(xué)觀察比較法 在加藥24 h后，加入MTT 10 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，利用倒置顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用（s）表示，單因素方差分析（one way ANOVA）進(jìn)行組間比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Chinensiolide A對肺腺癌A549細(xì)胞的影響 在濃度1~50 μmol/L間Chinensiolide A對肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用隨濃度的增長而增加，存活率依次降低。在10、20 μmol/L兩濃度藥物作用下抑制率差距尤為顯著，在50 μmol/L時，Chinensiolide A對人肺癌A549細(xì)胞活力的抑制率已高達(dá)98.37%，提示Chinensiolide A在低濃度對A549細(xì)胞也有較強(qiáng)的抑制作用。Chinensiolide A對人肺癌A549細(xì)胞IC50值是17.79 μmol/L，見表 1。

表1 Chinensiolide A對人肺癌A549細(xì)胞活力的抑制作用（s）%

表1 Chinensiolide A對人肺癌A549細(xì)胞活力的抑制作用（s）%

*與空白對照組比較，P<0.01；1~50 μmol·L-1Chinensiolide A各組間兩兩比較，P<0.01

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2.2 Chinensiolide A對肝癌Ble-7402細(xì)胞的影響 在濃度1~50 μmol/L濃度范圍內(nèi)，Chinensiolide A對肝癌Ble-7402細(xì)胞的抑制率由0.68%升至85.27%，抑制作用隨藥物濃度的增加而增長，且各濃度組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其濃度依賴關(guān)系顯著。Chinensiolide A對肝癌Ble-7402細(xì)胞的IC50值為25.75 μmol/L，見表 2。

表2 Chinensiolide A對人肺癌BEL-7402細(xì)胞活力的抑制作用（s） %

表2 Chinensiolide A對人肺癌BEL-7402細(xì)胞活力的抑制作用（s） %

*與空白對照組比較，P<0.01；1~50 μmol/L Chinensiolide A各組間兩兩比較，P<0.01

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2.3 Chinensiolide A對結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞的影響 在濃度1~50 μmol/L濃度范圍內(nèi)，Chinensiolide A對結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞的抑制作用隨濃度的增長而增加，抑制作用由1.12%增至99.57%，接近于全部抑制；且各組之間抑制率變化幅度較大，尤其在濃度1、10 μmol/L濃度和40、50μmol/L濃度之間變化近30個百分點(diǎn)，說明其抑制作用呈現(xiàn)出一定的濃度依賴趨勢。Chinensiolide A對結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞的IC50值為13.6 μmol/L，見表3。

表3 Chinensiolide A對人肺癌LoVo細(xì)胞活力的抑制作用（s）%

表3 Chinensiolide A對人肺癌LoVo細(xì)胞活力的抑制作用（s）%

*與空白對照組比較，P<0.01；1~50 μmol·L-1Chinensiolide A各組間兩兩比較，P<0.01

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2.4 形態(tài)學(xué)觀察 結(jié)果顯示空白組細(xì)胞貼壁正常生長、分裂，呈不規(guī)則形狀，部分細(xì)胞中有多個細(xì)胞核且細(xì)胞核較大，顏色較深，細(xì)胞之間緊密排列，生長狀態(tài)良好。藥物組細(xì)胞生長緩慢，部分細(xì)胞死亡，藥物對3種腫瘤細(xì)胞的生長有不同程度的殺傷作用，對每種腫瘤細(xì)胞的抑制作用隨濃度的增加作用增強(qiáng)。加入MTT后，能清楚看出存活的細(xì)胞，與空白對照組相比，Chinensiolide A的濃度在50μmol/L時，對3種細(xì)胞系抑制作用最強(qiáng)。

3 討論

如今腫瘤儼然成為21世紀(jì)一大難題，關(guān)于治療腫瘤疾病的課題也成為世界大熱點(diǎn)，中藥具有多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)抗腫瘤的作用，并且毒性小，副作用低，源于自然，藥源豐富，國內(nèi)外對單味中藥提取物抗腫瘤作用進(jìn)行了廣泛而深入的研究[8-13]。中華苦荬菜具有多方面的生物活性，包括抗炎、抗煙堿、抗氧化、抗病毒、抗白血病等，其根部提取物Chinensiolide A為愈創(chuàng)木烷型倍半萜內(nèi)酯類化合物[14-15]。本實(shí)驗(yàn)通過研究Chinensiolide A在3種人源腫瘤細(xì)胞系——人肺癌A549細(xì)胞、人肝癌BEL-7402細(xì)胞和人結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞的抗腫瘤活性，首次探究出其較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

本課題組經(jīng)過在藥物濃度1~1000 μmol/L范圍內(nèi)的初步研究，發(fā)現(xiàn)Chinensiolide A對三種腫瘤細(xì)胞系均有不同程度的抑制作用，且作用顯著。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，Chinensiolide A濃度大于50 μmol/L時，細(xì)胞存活率均小于10%，隨著濃度的增加存活率明顯下降，發(fā)現(xiàn)該藥對三種細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，且作用比較明顯，從而根據(jù)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)，將濃度確定在1~50 μmol/L準(zhǔn)確測量，來獲得準(zhǔn)確的IC50數(shù)值。結(jié)果顯示中華苦荬菜提取物Chinensiolide A對肺腺癌A549細(xì)胞、肝癌Bel-7402細(xì)胞、結(jié)直腸腺癌LoVo細(xì)胞有明顯抑制作用，IC50 分別是 17.79 μmol/L、25.75 μmol/L、13.6 μmol/L。

綜上所述，中華苦荬菜提取物Chinensiolide A具有一定的抗腫瘤活性，在對三種細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中，Chinensiolide A對A549細(xì)胞、LoVo細(xì)胞的抑制作用要較對Bel-7402細(xì)胞顯著。因此，Chinensiolide A在抗腫瘤方面具有很好的發(fā)展前景，值得深入探究，在接下來的研究中，可以通過抗腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯、凋亡、分化，腫瘤免疫以及動物水平等各種研究方法來更精確地了解抗腫瘤機(jī)制。

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