吳丹彤 李均 姚蘭

終末期腎衰竭是各種慢性腎臟病的晚期，而腎間質(zhì)纖維化（Renal interstitial fibrosis，RIF）是所有慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的共同途徑。蛋白尿是多種腎臟疾病常見的癥狀，是腎小球疾病中最常見的臨床表現(xiàn)之一，其不僅反映腎小球損傷的程度，且大量實(shí)驗(yàn)研究表明，蛋白尿是慢性腎病進(jìn)展的獨(dú)立致病因素[1]。研究發(fā)現(xiàn)，尿蛋白的主要成分是白蛋白，對近端腎小管上皮細(xì)胞存在直接損害作用，白蛋白過度重吸收與腎小管上皮細(xì)胞增殖、凋亡失衡以及表型轉(zhuǎn)分化等有密切關(guān)系[2]。因此，蛋白尿是公認(rèn)的能反映多種腎臟病預(yù)后的因素，也是引起小管間質(zhì)損傷及腎臟疾病的重要因素。早期生長反應(yīng)因子（Early growth response gene-1，Egr-1）能被低氧、缺血、多肽生長因子及尿素等多種刺激因素誘導(dǎo)，并能調(diào)控下游多種基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的生長、分化、增殖和凋亡[3]。Egr-1可通過促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）表達(dá)，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）積聚進(jìn)一步參與腎纖維化[4-5]。本研究擬觀察人血清白蛋白超載人腎小管上皮細(xì)胞（HK-2）對Egr-1表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討白蛋白對HK-2的損害機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小管上皮細(xì)胞購自廣州凱基，胎牛血清（Gibco公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），人血清白蛋白（純度98%、Sigma公司），小鼠抗人Egr-1單克隆抗體（Abcam：產(chǎn)品編號ab55160），SDS電泳凝膠試劑盒、BCA蛋白檢測盒、ECL化學(xué)發(fā)光底物、羊抗小鼠二抗（均購自武漢博士德），脫脂奶粉（購自Sigma，美國）。

1.2 主要儀器 SW-CJ-2F（標(biāo)準(zhǔn)型）雙人雙面垂直工作臺；二氧化碳培養(yǎng)箱（HF90）；臺式高速冷凍離心機(jī)（D37520） Thermo Fisher，德國；DY-CZ-24D型電泳槽，北京市六一儀器廠；DYY-2C型電泳儀，北京六一儀器廠；半干轉(zhuǎn)印儀，美國BIO-RAD。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將HK-2細(xì)胞于含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件5% CO2，37 ℃培養(yǎng)。每2~3天換液1次，每3~5天傳代1次。鏡下觀察細(xì)胞生長至90%~95%融合時，用0.25%胰酶消化后，待鏡下觀察細(xì)胞間隙增大后移除胰酶加入含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液終止消化，按1∶2~1∶3傳代。待細(xì)胞長至90%~95%融合時，用無血清培養(yǎng)基同步化24 h。細(xì)胞隨機(jī)分為A、B、C、D四組并分別給予不同濃度的人血清白蛋白培養(yǎng)，A組濃度為0 mg/mL、B組濃度為10 mg/mL、C組濃度為20 mg/mL、D組濃度為40 mg/mL，實(shí)驗(yàn)分別觀察24、48和72 h。

1.3.2 觀察指標(biāo)及方法 免疫印跡檢測Egr-1的表達(dá)：HK-2細(xì)胞經(jīng)藥物處理后分別于24、48和72 h收集細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷的PBS漂洗3次，加入100 μL細(xì)胞裂解液（每1 mL裂解液內(nèi)含10 μL蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min后刮下細(xì)胞，收集于1.5 mL EP管中，于4 ℃、12 000 r/min離心15 min后，取上清液，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后于10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，電泳完畢后用BIO-RAD半干轉(zhuǎn)印儀將蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 μm NC膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min后，先用小鼠抗人Egr-1單克隆抗體（Abcam公司，1∶200稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗4次，洗膜10 min/次，再加入羊抗小鼠IgG抗體（博士德公司，1∶3000稀釋）室溫下孵育2 h，最后經(jīng)ECL化學(xué)發(fā)光底物在X片上顯色并曝光成像，掃描X光片結(jié)果條帶后，Image-Pro Plus 6.0測定光密度值，使用特異性基因光密度/管家基因光密度（42KD β-actin）相對定量比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，每組實(shí)驗(yàn)分別重復(fù)3次，計(jì)量資料采用（s）表示，多組資料間比較采用單因素方差分析，LSD法檢驗(yàn)比較組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

人血清白蛋白對腎小管上皮細(xì)胞Egr-1蛋白表達(dá)的影響如下：表1示24 h時與A組比較，B、C、D組Egr-1蛋白相對表達(dá)均有不同程度升高，其中B、C組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），D組Egr-1相對表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；48、72 h與A組比較，B、C、D組Egr-1相對表達(dá)均有不同程度升高，其中B組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），C、D組Egr-1相對表達(dá)均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明藥物組Egr-1相對表達(dá)隨人血清白蛋白濃度增加及時間延長呈逐漸增加趨勢，見圖1。

表1 人血清白蛋白對腎小管上皮細(xì)胞Egr-1/β-catenin表達(dá)的影響

圖1 人血清白蛋白對腎小管上皮細(xì)胞Egr-1、β-catenin蛋白表達(dá)的影響

3 討論

RIF是慢性腎臟病發(fā)展成終末期腎病的主要病理基礎(chǔ)，是各種腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎功能衰竭的共同途徑，是臨床加重慢性腎衰進(jìn)程的重要環(huán)節(jié)[6]。蛋白尿是腎臟損傷的重要標(biāo)志，蛋白尿的程度是預(yù)測多種腎臟疾病嚴(yán)重性和惡化趨勢的重要指標(biāo)，同時蛋白尿也作為一個獨(dú)立的致病因素參與腎臟疾病進(jìn)展[7]。體外實(shí)驗(yàn)表明，蛋白尿的主要成分白蛋白是促腎小管間質(zhì)纖維化的主要因素，超負(fù)荷的尿蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至腎小管中會引起腎間質(zhì)炎癥和免疫反應(yīng)的發(fā)生，可介導(dǎo)白介素-8（IL-8）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）、TGF-β及一氧化氮等因子表達(dá)，這些因子在促進(jìn)腎小管間質(zhì)損害中起重要作用[8-9]。腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（TMET）是腎小管間質(zhì)纖維化的病理基礎(chǔ)，實(shí)驗(yàn)表明白蛋白可誘導(dǎo)TGF-β、整合素連接激酶（ILK）、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、鈣粘附蛋白E（E-cadherin）及纖連蛋白（FN）mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)TMET發(fā)生，進(jìn)而參與致腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展[10-11]。此外，白蛋白還可能通過促進(jìn)Ⅳ型膠原（col-Ⅳ）的合成及上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）使ECM積聚，進(jìn)一步參與腎間質(zhì)纖維化[12]。白蛋白可通過ERK、TGF-β1/Smad、Akt、Notch等信號通路而參與腎纖維化發(fā)生發(fā)展[13-16]。

早期生長反應(yīng)因子（Early growth response gene-1，Egr-1）又稱為NFGI-A、Krox24、TIS8等，是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，是即刻早期基因（immediate early gene）家族成員之一，該家族包括Egr-1、Egr-2、Egr-3、Egr-4、c-Jun等 30多種成員[3]。Egr-1在腎臟的腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞均可檢測到表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)后可調(diào)控包括血小板衍生生長因子（PDGF-C）、細(xì)胞間黏附分子-1、TGF-β等一系列基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的生長、分化、增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生[4-5]。很多學(xué)者均認(rèn)為，Egr-1參與了腎組織纖維化的發(fā)生發(fā)展[17-20]。TGF-β是公認(rèn)的致纖維因子，其可通過Smad通路，誘導(dǎo)Egr-1 mRNA和蛋白表達(dá)，且表達(dá)的TGF-β本身又可作為刺激源激活Egr-1表達(dá)，可推測TGF-β可引發(fā)Egr-1的促纖維化反應(yīng)。在UUO模型中，將DNA酶導(dǎo)入成纖維細(xì)胞內(nèi)，可下調(diào)TGF-β、α-SMA、FN和Ⅰ型膠原（col-Ⅰ）mRNA表達(dá)，抑制肌成纖維細(xì)胞形成，起到抗腎間質(zhì)纖維化的作用[21]。實(shí)驗(yàn)表明，激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶/絲裂原活化蛋白激酶（Erk/MPARK）信號途徑可使Egr-1轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致PDGF-C表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)腎纖維化的發(fā)展[22]。此外，Egr-1通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞生成、細(xì)胞外基質(zhì)聚積等參與腎纖維化，因此Egr-1可能是器官纖維化發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[23]。

本實(shí)驗(yàn)采用人血清白蛋白干預(yù)HK-2細(xì)胞24、48、72 h時，發(fā)現(xiàn)各個時間段EGR-1表達(dá)均增加，但在40 mg/mL人血清白蛋白刺激時可穩(wěn)定使EGR-1表達(dá)明顯增加，因此推斷人血清白蛋白有可能通過上調(diào)Egr-1表達(dá)，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。綜上所述，人血清白蛋白在一定范圍內(nèi)能以劑量和時間依賴方式誘導(dǎo)培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞誘導(dǎo)Egr-1蛋白表達(dá)增加。

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