周軍，朱靈，曹海軍，李善高，呂賓

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江 杭州 310006)

藥物性肝損傷與免疫性肝損傷肝組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的差異分析*

周軍，朱靈，曹海軍，李善高△，呂賓

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江 杭州 310006)

目的:研究長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在藥物性肝損傷及免疫性肝損傷中表達(dá)譜的變化，并分析二者的差異。方法:利用lncRNA芯片技術(shù)分別檢測(cè)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠藥物性肝損傷及刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷肝組織的lncRNA表達(dá)譜，通過對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理達(dá)到均一化后，篩選出差異表達(dá)lncRNA并進(jìn)行分析。結(jié)果:與正常肝臟組織比較，變化1.5倍以上并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的lncRNA被認(rèn)為是差異表達(dá)的lncRNA;藥物性肝損傷肝組織中變化1.5倍以上的共68條，其中升高1.5倍以上的共21條，降低1.5倍以上的共47條;免疫性肝損傷肝組織中變化1.5倍以上的共60條，其中升高1.5倍以上的共17條，降低1.5倍以上的共43條。所有的lncRNA中有8條lncRNA同時(shí)在2種肝損傷肝組織中上調(diào)，在藥物性肝損傷肝組織上調(diào)的lncRNA中占38%，在免疫性肝損傷肝組織中占47%;有28條lncRNA同時(shí)在2種肝損傷肝組織中下調(diào)，在藥物性肝損傷肝組織下調(diào)的lncRNA中占59%，在免疫性肝損傷肝組織中占65%。結(jié)論:與正常肝臟組織比較，藥物性肝損傷肝組織和免疫性肝損傷肝組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜均發(fā)生明顯變化，且2種不同肝損傷肝組織比較，lncRNA表達(dá)譜也存在差異，提示2種肝損傷肝組織中這些同時(shí)上、下調(diào)的lncRNA可能參與了2種肝損傷之間相似或是相同的病理生理過程，而那些表達(dá)不同的lncRNA可能參與相對(duì)特異的肝損傷機(jī)制的發(fā)生。

lncRNA;lncRNA芯片;藥物性肝損傷;免疫性肝損傷

藥物性肝損傷(drug－induced liver injury，DILI)和免疫性肝損傷(immune liver injury，ILI)是臨床上2種常見的肝損傷類型，是肝纖維化、肝硬化乃至肝臟腫瘤等終末期肝病發(fā)生及發(fā)展的重要病因，二者發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non－coding RNA，lncRNA)作為一種長(zhǎng)度超過200 nt (核苷酸單位)的非編碼RNA，曾被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄過程的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能［1］，但進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，它們能夠在多種水平調(diào)控基因的表達(dá)，廣泛參與機(jī)體幾乎所有的生理和病理過程［2］。本研究試圖采用對(duì)乙酰氨基酚及刀豆蛋白A分別復(fù)制的DILI及ILI動(dòng)物模型，運(yùn)用lncRNA芯片技術(shù)檢測(cè)2種肝損傷肝組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜的變化并比較二者的差異，旨在為進(jìn)一步研究lncRNA是否參與2種肝損傷發(fā)生機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 動(dòng)物和試劑

健康SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠，體質(zhì)量約(20± 2)g，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。

對(duì)乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)由日本梯希愛公司提供，臨用前用無菌生理鹽水配制成濃度為12.5 g/L溶液;刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)由Sigma提供，臨用前用無菌生理鹽水配成濃度為1 g/L溶液;AST和ALT采用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。選用Mouse lncRNA表達(dá)陣列，芯片的選擇、探針設(shè)計(jì)、圖像采集和數(shù)據(jù)分析等由上海欣基生物科技有限公司完成。

2 方法

2.1 模型制備雄性BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量(20±2)g，同步飼養(yǎng)，適應(yīng)1周后，隨機(jī)分為藥物組(DILI組)及對(duì)照組A(control A)、免疫組(ILI組)及對(duì)照組B(control B)，每組10只。DILI組按對(duì)乙酰氨基酚溶液0.04 mL/g一次性腹腔注射給藥，control A一次性腹腔注射相當(dāng)量的無菌生理鹽水。ILI組按刀豆蛋白A溶液0.02 mL/g一次性尾靜脈注射給藥，control B一次性尾靜脈注射相當(dāng)量的無菌生理鹽水。

2.2 樣本采集于DILI組及control A給藥24 h后、ILI組及control B給藥12 h后分別行小鼠眼球取血，分離血清用于AST和ALT檢測(cè);處死后取新鮮肝組織于－80℃保存用于lncRNA檢測(cè)，另取肝組織浸泡于10%甲醛中，用于組織病理學(xué)檢查。

2.3 血清ALT和AST活性的檢測(cè)采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定各組動(dòng)物血清ALT和AST水平。

2.4 肝臟組織的病理學(xué)檢查取浸泡于10%甲醛中肝臟組織，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)變化。

2.5 芯片選擇和探針設(shè)計(jì)利用Affymetrix公司的GeneChip Mouse Gene 2.0 Array，覆蓋目前RefSeq、Ensemble、FANTOM3和lncRNAdb等多個(gè)數(shù)據(jù)庫的lncRNA。Affymetrix lncRNA芯片設(shè)計(jì)探針采用25 mer的寡核苷酸。用于芯片雜交中質(zhì)量評(píng)估的外標(biāo)基因包括BioB、BioC、BioD和Cre，由Affymetrix提供，作為雜交過程的對(duì)照。

2.6 樣本總RNA的提取與檢測(cè)按照Trizol說明書，分別提取對(duì)照組肝組織和2種肝損傷肝組織的總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值A(chǔ)260和A280，對(duì)總RNA進(jìn)行定量;并計(jì)算A260/A280值，結(jié)合甲醛變性凝膠電泳，分析RNA質(zhì)量。

2.7 芯片實(shí)驗(yàn)利用Invitrogen提供的ds－cDNA合成試劑盒，完成cDNA的合成，利用GeneChip WT Terminal Labeling and Controls Kit試劑盒進(jìn)行完成cDNA樣品標(biāo)記和雜交。利用GeneChip Scanner 3000 7G掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，然后將掃描圖像輸入Affymetrix GeneChip Operating Software以進(jìn)行網(wǎng)格對(duì)齊與表達(dá)數(shù)據(jù)分析，采用Affymetrix Expression Console進(jìn)行數(shù)據(jù)解析。

2.8 Real－time PCR驗(yàn)證挑選變化倍數(shù)最大的lncRNA進(jìn)行real－time PCR驗(yàn)證，分別以來自藥物組、免疫組及相應(yīng)對(duì)照組cDNA分子為模板，采用Bio－Rad熒光定量PCR儀，SYBR Green熒光染料(TaRa－Ka)摻入法相對(duì)定量。以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算差異表達(dá)的倍數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS 17.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 血清AST與ALT的檢測(cè)結(jié)果

小鼠注射對(duì)乙酰氨基酚24 h及注射刀豆蛋白A 12 h后，肝臟均受到損傷，DILI組及ILI組的血清ALT和AST活性較相對(duì)應(yīng)空白組均明顯增高，且差異顯著(P＜0.01);control A、B組之間比較ALT和AST活性無明顯差異，見表1。

表1 DILI和ILI小鼠血清ALT和AST活性的變化Table 1.Changes of serum alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)activitiy in DILI mice and ILI mice(U/L.Mean±SD.n=10)

2 組織病理學(xué)的改變

肉眼可見DILI組及ILI組肝臟充血、淤血明顯。鏡下觀:DILI組肝細(xì)胞腫脹、壞死，以實(shí)質(zhì)細(xì)胞點(diǎn)狀及局灶性壞死明顯，肝細(xì)胞核崩解，染色質(zhì)凝集，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，有廣泛炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝血竇消失，肝竇狀隙和中央靜脈淤血、出血;ILI組肝細(xì)胞腫脹、細(xì)胞漿疏松化，有的呈氣球樣變，可見點(diǎn)狀壞死和灶性壞死，并伴大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以匯管區(qū)為明顯，肝竇內(nèi)可見紅細(xì)胞瘀積。所對(duì)應(yīng)的control A組及control B組小鼠肝臟均未見以上改變。

3 總RNA樣本質(zhì)量分析

每份樣品總RNA的A260/A280均在1.8～2.0之間，總量都在30 μg到80 μg之間?？俁NA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見到18S和28S兩條亮而濃的條帶，并且28S的密度大約是18S的2倍。下方有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA (tRNA和5S核糖體RNA等)組成，在28S和18S核糖體帶之間一般可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。結(jié)果證實(shí)獲得較高純度的總RNA。

4 芯片雜交質(zhì)量的評(píng)估

對(duì)雜交后小鼠基因芯片的掃描分析顯示，芯片的四角點(diǎn)陣和芯片的陣列名標(biāo)志清晰，芯片中間的“+”符號(hào)也清晰可見;從芯片雜交分析的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)可見，各組芯片的信號(hào)值高于背景值，表示信號(hào)值與背景值正常;外加的陽性對(duì)照BioB、BioC、BioD和Cre均能檢測(cè)到，且信號(hào)值(3’/5’)均小于3。以上說明各組芯片雜交和檢測(cè)的質(zhì)量較高，結(jié)果可靠。

5 芯片雜交結(jié)果

對(duì)照組小鼠肝組織及肝損傷肝組織芯片雜交后的微點(diǎn)陣圖片表明:DILI組與對(duì)照組比較，變化1.5倍以上并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的lncRNA共68條，其中升高1.5倍以上的共21條，降低1.5倍以上的共47條(表2);ILI組與對(duì)照組比較，變化1.5倍以上并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的lncRNA共60條，其中升高1.5倍以上的共17條，降低1.5倍以上的共43條(表3)。有8條lncRNA同時(shí)在2種肝損傷肝組織中上調(diào)，在DILI肝組織上調(diào)的lncRNA中占38%，在ILI肝組織中占47%(表4);有28條lncRNA同時(shí)在2種肝損傷肝組織中下調(diào)，在DILI肝組織下調(diào)的lncRNA中占59%，在ILI肝組織中占65%(表5)。2對(duì)照組之間并未發(fā)現(xiàn)有變化1.5倍以上并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)的lncRNA。

表2 DILI肝組織中差異表達(dá)的lncRNATable 2.The differentially expressed lncRNA(fold change＞1.5)in DILI group

Table 2.(continued)

表3 ILI肝組織中差異表達(dá)的lncRNATable 3.The differentially expressed lncRNA(fold change＞1.5)in ILI group

Table 3.(continued)

表4 藥物性肝損傷肝組織及免疫性肝損傷肝組織中同時(shí)上調(diào)的lncRNATable 4.The simultaneously up－regulated lncRNA in DILI and ILI groups

表5 藥物性肝損傷肝組織及免疫性肝損傷肝組織中同時(shí)下調(diào)的lncRNATable 5.The simultaneously down－regulated lncRNA in DILI and ILI groups

6 Real-time PCR結(jié)果

采用real－time PCR進(jìn)一步測(cè)定2種肝損傷小鼠肝組織中同時(shí)存在且顯著差異的4種lncRNA (A130040M12Rik、LOC100862007、C730036E19Rik和Gm19894)的表達(dá)情況。與對(duì)照組的肝組織相比，A130040M12Rik和LOC100861856表達(dá)上調(diào)，C730036E19Rik和Gm19894表達(dá)下調(diào)，見圖1，與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。

討論

現(xiàn)已有的研究表明lncRNA廣泛參與多種肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過程。如HULC在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)患者肝癌組織及血液標(biāo)本中均高表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HULC可以下調(diào)miRNA－372，并抑制其靶基因的表達(dá)［3－4］。HOTAIR可以促進(jìn)HCC細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲能力，敲除HOTAIR可促進(jìn)TNF－α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及增加癌細(xì)胞對(duì)順鉑、多柔比星的化療敏感性［5］。MEG3可顯著抑制HCC細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［6］。H19可以抑制HCC的轉(zhuǎn)移，并且抑制上皮－間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)關(guān)鍵分子的表達(dá)［7］。lncRNA－LALR(an lncRNA associated with liver regeneration)可以通過激活Wnt/β信號(hào)通路來抑制AXIN1，從而促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，通過促進(jìn)細(xì)胞周期過程增強(qiáng)肝細(xì)胞的再生，為肝衰竭及肝移植方面研究提供新的思路［8］。在有馬洛里小體形成的酒精性肝病及非酒精性肝病的小鼠肝細(xì)胞中，可發(fā)現(xiàn)H19表達(dá)上調(diào)，MEG3表達(dá)下調(diào)，喂養(yǎng)S－腺苷甲硫胺酸能夠阻止上述lncRNA的改變［9］。以上表明lncRNA在肝臟多種疾病的發(fā)生及發(fā)展中均發(fā)揮著重要的作用，但目前這些我們已鑒定功能的lncRNA僅僅是依據(jù)生物信息學(xué)手段所推測(cè)數(shù)目的冰山一角［10］，而在DILI和ILI發(fā)生過程中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜是否發(fā)生變化，lncRNA是否也發(fā)揮重要作用，目前國內(nèi)外尚無文獻(xiàn)報(bào)道。

DILI和ILI在臨床上十分常見，且由于臨床表現(xiàn)類似、自身抗體特異性差及用藥和肝損傷之間的因果關(guān)系判斷困難，有時(shí)難以鑒別。2種肝損傷發(fā)病機(jī)制均較復(fù)雜，目前并未完全明確?，F(xiàn)有研究表明兩者之間也存在許多相同或相似的發(fā)病機(jī)制，如藥物或其代謝產(chǎn)物的致敏過程，炎癥因子如腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素參與的炎癥反應(yīng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，胞膜通透性的改變，肝組織過氧化損傷，肝細(xì)胞的凋亡或壞死等過程［11－13］。因此通過對(duì)DILI及ILI肝組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜差異的分析可望有助于更進(jìn)一步揭示2種肝損傷的發(fā)病機(jī)制以及為兩者的鑒別提供可能的線索。

Figure 1.Differentially expressed lncRNA identified by real－time PCR.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control A;##P＜0.01 vs control B.圖1 Real-time PCR檢測(cè)肝組織差異表達(dá)的lncRNA

本研究分別選用對(duì)乙酰氨基酚腹腔注射和刀豆蛋白A尾靜脈注射成功復(fù)制了藥物性肝損傷及免疫性肝損傷動(dòng)物模型，通過lncRNA芯片技術(shù)對(duì)2種肝損傷動(dòng)物模型的肝組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)譜分析，研究表明在2種肝損傷中同時(shí)上調(diào)的lncRNA有8條，同時(shí)下調(diào)的有28條，這些共lncRNA可能同時(shí)參與以上2種肝損傷共同的病理生理過程，但也不排除在其它的肝損傷，如酒精性肝病、脂肪性肝病或肝硬化中存在類似的差異表達(dá)，若進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)?zāi)茏C實(shí)，則可推斷這些lncRNA可能固定參與肝組織的損傷。除共同上、下調(diào)的lncRNA外，在DILI中尚有13條上調(diào)lncRNA和19條下調(diào)lncRNA相對(duì)于ILI較特異，而ILI中有9條上調(diào)的lncRNA和15條下調(diào)的lncRNA相對(duì)于DILI特異，進(jìn)一步針對(duì)性研究這些相對(duì)差異的lncRNA與某一種肝損傷之間的關(guān)系可能為揭示該類lncRNA在相應(yīng)肝損傷中的作用分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Kung JT，Colognori D，Lee JT.Long noncoding RNAs: past，present，and future［J］.Genetics，2013，193(3): 651－669.

［2］Ponting CP，Oliver PL，Reik W.Evolution and functions of long noncoding RNAs［J］.Cell，2009，136(4): 629－641.

［3］Panzitt K，Tschernatsch MM，Guelly C，et al.Characterization of HULC，a novel gene with striking up－regulation in hepatocellular carcinoma，as noncoding RNA［J］.Gastroenterology，2007，132(1):330－342.

［4］Wang J，Liu X，Wu H，et al.CREB up－regulates long non－coding RNA，HULC expression through interaction with microRNA－372 in liver cancer［J］.Nucleic Acids Res，2010，38(16):5366－5383.

［5］Yang Z，Zhou L，Wu LM，et al.Overexpression of long non－coding RNA HOTAIR predicts tumor recurrence in hepatocellular carcinoma patients following liver transplantation［J］.Ann Surg Oncol，2011，18(5):1243－1250.

［6］Braconi C，Kogure T，Valeri N，et al.MicroRNA－29 can regulate expression of the long non－coding RNA gene MEG3 in hepatocellular cancer［J］.Oncogene，2011，30 (47):4750－4756.

［7］Zhang L，Yang F，Yuan JH，et al.Epigenetic activation of the MiR－200 family contributes to H19－mediated metastasis suppression in hepatocellular carcinoma［J］.Carcinogenesis，2013，34(3):577－586.

［8］Xu D，Yang F，Yuan JH，et al.Long noncoding RNAs associated with liver regeneration 1 accelerates hepatocyte proliferation during liver regeneration by activating Wnt/βcatenin signaling［J］.Hepatology，2013，58(2): 739－751.

［9］Oliva J，Bardag－Gorce F，F(xiàn)rench BA，et al.The regulation of non－coding RNA expression in the liver of mice fed DDC［J］.Exp Mol Pathol，2009，87(1):12－19.

［10］韓澤平，何金花，黎毓光.長(zhǎng)鏈非編碼RNA與糖尿病關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.中國病理生理雜志，2014，30(4): 751－756.

［11］劉平，宋東眷.藥物性肝損傷的發(fā)病機(jī)理［J］.肝臟，2001，16(1):40.

［12］李子俊，謝子鈞.藥物性肝損傷的發(fā)病機(jī)制［J］.中華肝臟病雜志，2012，20(3):163－166.

［13］Wang HX，Liu M，Weng SY，et al.Immune mechanisms of concanavalin A model of autoimmune hepatitis［J］.World J gastroenterol，2012，18(2):119－125.

Differential expression profile of long non-coding RNA in hepatic tissue between drug-induced liver injury and immune liver injury

ZHOU Jun，ZHU Ling，CAO Hai－jun，LI Shan－gao，Lü Bin

(Department of Gastroenterology，The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，China.E-mail:galisga@aliyun.com)

AIM:To analyze the expression profile of long non－coding RNA(lncRNA)in the liver tissues of drug－induced liver injury(DILI)and immune liver injury(ILI).METHODS:The technique of lncRNA microarray was used to inspect the lncRNA expression profile in the mouse liver tissues that the liver injury was induced by acetaminophen or concanavalin A.The raw data of lncRNA were pretreated for normalization.RESULTS:Compared with normal hepatic tissue，the lncRNA which had more than 1.5－fold variation and significant difference(P＜0.05)by statistical analysis were regarded as lncRNA with differential expression.A total of 68 lncRNA with differential expression were found in the hepatic tissues of DILI，with 21 increased more than 1.5 folds and 47 reduced more than 1.5 folds.A total of 60 lncRNA with differential expression in the liver tissues of ILI were observed，with 17 increased more than 1.5 folds and 43 reduced more than 1.5 folds.In all lncRNA，8 was simultaneously up－regulated in 2 liver injury models，accounting for 38%and 47%respectively，while 28 was simultaneously down－regulated in 2 liver injury models，accounting for 59%and 65%respectively.CONCLUSION:lncRNA expression profiles of DILI and ILI change significantly in comparison with normal hepatic tissue，and there are also differences between 2 hepatic damage models.The simultaneous changes of lncRNA may participate in the same or similar pathophysiological process，while the differences may be involved in relatively particular mechanisms.

lncRNA;lncRNA microarray;Drug－induced liver injury;Immune liver injury

R393

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.022

1000－4718(2015)02－313－06

2014－08－20

2014－11－14

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.LY14H030007)

△通訊作者Tel:0571－86919331;E－mail:galisga@aliyun.com