費洪榮，王桂玲，趙瑩，周洪雷

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355;2泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，藥物化學(xué)山東省醫(yī)藥衛(wèi)生重點學(xué)科，山東 泰安 271016)

告達庭增強TRAIL誘導(dǎo)的HepG2細胞凋亡*

費洪榮1，2，王桂玲2，趙瑩2，周洪雷1△

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355;2泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，藥物化學(xué)山東省醫(yī)藥衛(wèi)生重點學(xué)科，山東 泰安 271016)

目的:研究C21甾體苷元告達庭對腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)誘導(dǎo)的HepG2肝癌細胞增殖和凋亡的影響，并進一步明確其作用機制。方法:采用MTT法和細胞集落形成實驗檢測告達庭與TRAIL聯(lián)合對細胞增殖的影響;TUNEL染色法檢測細胞凋亡的變化;免疫印跡實驗分析蛋白的表達水平。結(jié)果:告達庭與TRAIL聯(lián)合作用HepG2細胞24 h后，細胞活力明顯下降，細胞增殖受到抑制;同時，兩者聯(lián)用后細胞凋亡數(shù)目明顯增加，顯著高于告達庭和TRAIL單用誘導(dǎo)的細胞凋亡率;與對照相比，告達庭與TRAIL聯(lián)用促進了caspase－3、caspase－7、caspase－9和PARP的活性切割，而凋亡抑制蛋白survivin的表達則下調(diào)。結(jié)論:告達庭能夠增強TRAIL誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，其機制可能與激活caspase家族因子的活性切割和抑制survivin的表達相關(guān)。

告達庭;腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體;癌，肝細胞;細胞凋亡;Caspases

肝細胞癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，國內(nèi)外臨床主要采取手術(shù)切除輔以化學(xué)藥物治療的方案。聯(lián)合化學(xué)藥物治療對提高臨床療效，延長患者生存時間有重要意義。近年來，腫瘤壞死因子凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand，TRAIL)介導(dǎo)的細胞凋亡療法在腫瘤的臨床治療中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。TRAIL是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族中的一個新型凋亡分子，可選擇性誘導(dǎo)多種腫瘤細胞發(fā)生凋亡，而不影響正常細胞的生存［1－2］。然而，研究發(fā)現(xiàn)許多腫瘤細胞對TRAIL表現(xiàn)出較高的耐受性。因此，探索逆轉(zhuǎn)TRAIL耐藥的機制與方案，對增強TRAIL的生物活性及其臨床應(yīng)用具有重要價值［3］。

告達庭(caudatin)是從蘿藦科植物耳葉牛皮消(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)或戟葉牛皮消(Cynanchum bungei Decne)的干燥根莖(白首烏)中分離得到的一種C21甾體苷元。我們前期研究發(fā)現(xiàn)告達庭在多種腫瘤細胞中表現(xiàn)出較強的抑癌活性，能夠通過阻滯細胞周期的進程來抑制腫瘤細胞增殖;通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡;同時對腫瘤細胞的遷移和血管生成也表現(xiàn)出顯著的抑制作用［4－6］。本研究以人肝癌HepG2細胞為實驗材料，觀察告達庭聯(lián)合TRAIL對肝癌細胞增殖與凋亡的影響，并闡明其內(nèi)在的分子機理，以期為肝細胞癌的臨床治療提供有效的用藥參考。

材料和方法

1 材料

HepG2細胞(中國科學(xué)院上海細胞庫);重組人TRAIL/Apo2(PeproTech);MTT(Sigma);TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(Roche);ECL Western blotting顯色試劑盒(Pierce);pro－caspase－3、pro－caspase－7、procaspase－9、survivin和聚(ADP－核糖)聚合酶［poly (ADP－ribose)polymerase，PARP］抗體(Cell Signaling);β－actin抗體(Sigma);DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco);II抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);告達庭(自制，純度98.2%)［7］。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)HepG2細胞采用DMEM高糖培養(yǎng)液，含10%胎牛血清，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 MTT法測定細胞活力胰酶消化細胞并接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，加入50 μmol/L告達庭，100 μg/L TRAIL以及兩者合用處理HepG2細胞后繼續(xù)培養(yǎng)，對照組加入DMSO。終止培養(yǎng)前4 h加20 μL(5 g/L)的MTT于各個孔中，然后吸去孔中的培養(yǎng)液，接著加入150 μL的DMSO并振蕩10 min;490 nm波長下測定各孔的A值，以同樣的方法測6個平行孔，對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，實驗重復(fù)3次。

2.3 細胞集落形成實驗細胞以每孔5×103個接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入40 μmol/L告達庭，100 μg/L TRAIL以及兩者合用處理HepG2細胞。置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，去除培養(yǎng)基，甲醇固定10 min，臺盼藍染色20 min，鏡下觀察并計數(shù)細胞集落形成數(shù)(＞30個細胞)。實驗重復(fù)3次。

2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡細胞經(jīng)藥物作用24 h后，PBS洗滌細胞3次，接著4℃固定細胞1 h，0.1%Triton X－100打孔2 min。然后按照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書對細胞進行凋亡染色，倒置熒光顯微鏡觀察細胞的TUNEL染色結(jié)果，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2.5 免疫印跡分析細胞用預(yù)冷PBS洗2次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液冰上放置15～20 min，4℃13 000×g離心20 min，收集上清用于蛋白定量。取30 μg總蛋白進行SDS－PAGE分離蛋白，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h;然后加入I抗，室溫孵育3 h;加入II抗，室溫孵育2 h;最后PBST洗膜，ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 告達庭聯(lián)合TRAIL對HepG2細胞增殖的抑制作用

MTT結(jié)果表明，50 μmol/L告達庭與TRAIL(100 μg/L)合用后，HepG2細胞活力明顯受到抑制，見圖1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。同時，細胞集落形成實驗結(jié)果顯示，40 μmol/L告達庭和100 μg/L TRAIL聯(lián)合應(yīng)用明顯抑制了HepG2細胞的增殖，見圖2。

Figure 1.Caudatin enhanced TRAIL－induced cytotoxicity in the HepG2 cells.The cells were co－treated with 50 μmol/ L caudatin and 100 μg/L TRAIL for 24 h，and the cell viability was determined by MTT assay.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs caudatin group.圖1 告達庭增強TRAIL對HepG2細胞活力的抑制作用

2 告達庭與TRAIL聯(lián)用促進HepG2細胞的凋亡

脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標記法(TUNEL)檢測了告達庭與TRAIL合用對HepG2細胞凋亡的影響。從圖3可以看出，50 μmol/L告達庭與100 μg/L TRAIL聯(lián)用24 h后，與對照組及單獨用藥組相比，HepG2細胞的凋亡數(shù)目明顯增加。

Figure 2.Combination of caudatin(40 μmol/L)with TRAIL(100 μg/L)inhibited the colony formation ability of HepG2 cells.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs caudatin group.圖2 告達庭與TRAIL聯(lián)用抑制HepG2細胞集落的形成

Figure 3.The HepG2 cells were treated with TRAIL(100 μg/ L)alone or together with caudatin(50 μmol/L)for 24 h.After treatment，the apoptosis was detected by TUNEL assay.The number of apoptotic cells was expressed as percentage of total cell number.Mean± SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs caudatin group.圖3 TUNEL染色法檢測細胞的凋亡

3 告達庭與TRAIL合用對凋亡相關(guān)蛋白的影響

為了進一步確定聯(lián)合用藥對于HepG2細胞凋亡的協(xié)同作用并探討可能的機制，免疫印跡實驗檢測了與細胞凋亡密切相關(guān)的caspase－3、caspase－7、caspase－9和PARP的表達。與單獨處理組相比，告達庭和TRAIL聯(lián)合組caspase－3、caspase－7和caspase－9活性切割體明顯增加，同時PARP的剪切片段明顯增多，見圖4。

4 告達庭與TRAIL合用抑制survivin的表達

由于細胞凋亡通路的重要抑制因子survivin的表達與腫瘤細胞的TRAIL耐受性關(guān)系密切［8］，本研究最后檢測告達庭和TRAIL聯(lián)用對survivin蛋白表達的影響。免疫印跡結(jié)果表明，告達庭和TRAIL聯(lián)用協(xié)同抑制了survivin的表達，見圖5。

討論

泰山白首烏為蘿摩科鵝絨藤屬植物戟葉牛皮消的干燥塊根，富含多糖類、C21甾體類以及卵磷脂類等活性成分，具有補血益精、延年益壽等功效，其醇提物能夠抑制肝癌細胞增殖［9］。從白首烏中分離的C21甾體苷元告達庭具有良好抗癌活性，可通過調(diào)控wnt/β－catenin信號通路來抑制細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡，進而發(fā)揮抗腫瘤效果［4］。本研究發(fā)現(xiàn)告達庭可增強肝癌細胞HepG2對靶向生物制劑TRAIL的敏感性。MTT和細胞集落形成實驗結(jié)果顯示，告達庭與TRAIL合用顯著抑制HepG2細胞的增殖，TUNEL染色證實兩者聯(lián)用可協(xié)同誘導(dǎo)細胞凋亡。同時，凋亡相關(guān)的caspase－3、caspase－7、caspase－9和PARP的切割體增加。另外，凋亡抑制蛋白survivin的表達也受到抑制。

作為TNF家族的關(guān)鍵成員之一，TRAIL能特異性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡而對正常細胞無毒性，因此在腫瘤治療上具有廣闊的前景。與TNF超家族其它成員一樣，TRAIL以同源3聚體作為活性單位，與細胞表面特異性死亡受體(death receptor，DR)結(jié)合而發(fā)揮功能。目前被鑒定出來的死亡受體主要包括TRAILR1(DR4)和死亡受體TRAILR2(DR5)［10］。TRAIL能夠分別與DR4和DR5受體結(jié)合，然后募集接頭分子FADD(Fas－associated death domain protein)，與細胞內(nèi)的胱天蛋白酶原結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物，最后將活化信號傳遞并激活caspase－3，從而發(fā)揮誘導(dǎo)細胞凋亡的生物學(xué)功能［11－12］。然而有研究表明，包括HepG2肝癌細胞在內(nèi)的一些腫瘤細胞對TRAIL存在耐受性，因此如何增加TRAIL對腫瘤細胞敏感性已經(jīng)成為其研究重點之一。本研究將中藥提取物告達庭和TRAIL有效結(jié)合，體外檢測兩者聯(lián)用對HepG2細胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果表明，告達庭與TRAIL聯(lián)用能夠有效抑制HepG2細胞增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，其機制與激活caspase家族因子的活性切割和下調(diào)survivin的表達相關(guān)。

Figure 4.The effect of combination of caudatin with TRAIL on the expression of caspase－3，caspase－7，caspase－9 and PARP in the HepG2 cells.The HepG2 cells were exposed to TRAIL with or without caudatin for 24 h.Whole－cell extracts were prepared and analyzed by Western blotting.β－actin was served as a loading control.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs caudatin group.圖4 告達庭與TRAIL聯(lián)用對細胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響

Figure 5.The survivin levels in HepG2 cells determined by Western blotting.β－actin was used as an internal standard.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs caudatin group.圖5 免疫印跡法檢測HepG2細胞內(nèi)survivin的表達水平

Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族重要一員，也是一種腫瘤特異性凋亡抑制因子，其表達水平的異常增高與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此被認為是特異性靶向腫瘤治療的理想靶點［13］。在抑制細胞凋亡的過程中，survivin能夠分別通過死亡受體途徑和線粒體途徑，將抗凋亡信號傳遞給caspase－3和caspase－7，從而抑制細胞凋亡［14］。除了參與對細胞凋亡的抑制作用，survivin與腫瘤的放化療敏感性也關(guān)系密切［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，告達庭與TRAIL聯(lián)用顯著下調(diào)survivin表達，可能與兩者協(xié)同抑制肝細胞癌的活性相關(guān)。

總之，本研究表明告達庭能夠促進TRAIL誘導(dǎo)HepG2肝癌細胞的凋亡，這為今后兩者的聯(lián)合應(yīng)用治療肝細胞癌提供了實驗依據(jù)，也為綜合開發(fā)C21甾體苷類化合物的臨床用藥拓寬了思路。告達庭和TRAIL均表現(xiàn)出廣譜抗腫瘤能力，后續(xù)的研究工作在闡明告達庭增強TRAIL抑癌分子機制的同時，開展體內(nèi)動物實驗研究，為將TRAIL用于臨床腫瘤治療提供更多的實驗依據(jù)。

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Caudatin sensitizes TRAIL-induced HepG2 cell apoptosis

FEI Hong－rong1，2，WANG Gui－ling2，ZHAO Ying2，ZHOU Hong－lei1

(1School of Pharmacy，Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China;2School of Pharmacy，Taishan Medical University，Medicinal Chemistry，Medicine and Health Key Discipline in Shandong Province，Taian 271016，China.E-mail:zhouhongleitcm@163.com)

AIM:To determine whether caudatin，a C21steroidal aglycone，enhances tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand(TRAIL)－associated HepG2 cell apoptosis.METHODS:Cell growth inhibition was determined by MTT assay and cell colony formation assay.The TUNEL apoptosis detection kit was used to analyze cell apoptosis，and the protein expression was examined by Western blotting.RESULTS:Combination of caudatin with TRAIL significantly reduced cell proliferation and increased the apoptotic rate of HepG2 cells compared with the use of each agent alone.This was evidenced by marked increases in caspase－3，caspase－7，caspase－9 and PARP cleavages in the cells treated with caudatin and TRAIL－compared with control group.Combination of caudatin with TRAIL also led to the strong suppression of survivin.CONCLUSION:Caudatin synergizes HepG2 cells to TRAIL－induced apoptosis by promoting the cleavages of caspase－3，caspase－7，caspase－9 and PARP and inhibiting the expression of survivin.

Caudatin;Tumor necrosis factor－related apoptosis－inducing ligand;Carcinoma，hepatocellular; Apoptosis;Caspases

R285.5

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.016

1000－4718(2015)02－279－05

2014－09－29

2014－11－03

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81272683);山東省自然科學(xué)基金資助項目(No.ZR2011HQ034)

△通訊作者Tel:0531－89628065;E－mail:zhouhongleitcm@163.com