黃波，吳陽，薛萊，彭藝飛，邱紅梅，蔣青松

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

PPARβ及NO在高糖高胰島素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大中的作用*

黃波，吳陽，薛萊，彭藝飛，邱紅梅，蔣青松△

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

目的:觀察過氧化物酶體增殖物激活受體β(PPARβ)及一氧化氮(NO)相關(guān)信號通路在高糖高胰島素(HGI，25.5 mmol/L葡萄糖+0.1 μmol/L胰島素)誘導(dǎo)心肌肥大中的作用。方法:體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞，以細(xì)胞表面積、蛋白含量和心房鈉尿因子(ANF)mRNA表達(dá)作為心肌肥大的指標(biāo);利用real－time PCR、Western blotting、硝酸還原酶法和分光光度法分別檢測mRNA表達(dá)、蛋白表達(dá)、NO含量和NO合酶(NOS)活性。結(jié)果:HGI誘導(dǎo)心肌細(xì)胞出現(xiàn)肥大(P＜0.01)，PPARβ mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05)，誘導(dǎo)型NOS(iNOS)mRNA和蛋白的表達(dá)則升高(P＜0.01)，NO含量和NOS活性增加(P＜0.01)。PPARβ激動(dòng)劑GW0742能抑制HGI誘導(dǎo)的心肌肥大(P＜0.01)，上調(diào)PPARβ的表達(dá)，降低iNOS的表達(dá)，使NOS活性和NO含量恢復(fù)正常(P＜0.01)。PPARβ拮抗劑GSK0660可阻斷GW0742對心肌肥大的保護(hù)作用，取消其對PPARβ、iNOS mRNA和蛋白表達(dá)水平以及NOS活性和NO含量的作用(P＜0.05)。結(jié)論:PPARβ下調(diào)，激活iNOS－NO信號通路參與高糖高胰島素誘導(dǎo)心肌肥大過程。

過氧化物酶體增殖物激活受體β;誘導(dǎo)型一氧化氮合酶;一氧化氮;心肌肥大;高糖高胰島素

隨著生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率及相關(guān)死亡率越來越高;其并發(fā)癥，尤其心血管并發(fā)癥是糖尿病病人死亡的首要因素。流行病學(xué)調(diào)查顯示，糖尿病病人心血管疾病的發(fā)生率比無糖尿病的其他病人高2～5倍［1］。研究發(fā)現(xiàn)，在沒有高血壓和冠脈疾病存在的情況下，糖尿病本身即可引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的損傷，出現(xiàn)以心室肥厚、心室順應(yīng)性降低和峰充盈率減少為主要特征的糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)［2］。其中，心肌肥厚是DCM關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)改變，與糖尿病人心力衰竭、猝死等相關(guān)死亡的發(fā)生密切相關(guān)［3］，故對其病理生理機(jī)制的研究具有重要意義。

過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator－activated receptors，PPARs)是配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，參與脂質(zhì)代謝、胰島素敏感性、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長和增殖分化等重要生物調(diào)節(jié)過程［4－5］。PPARs的3種異構(gòu)體(α、β和γ)具有不同的配體親和力和生物學(xué)效應(yīng)。其中，PPARβ又稱為PPARδ或脂肪酸激活受體，廣泛表達(dá)于多種器官和組織，具有重要的生理調(diào)節(jié)作用［6］?，F(xiàn)有研究證實(shí)，在代謝綜合征相關(guān)疾病的治療中，PPARβ是一個(gè)重要的藥理學(xué)靶點(diǎn)［7］。但關(guān)于PPARβ在糖尿病心肌肥厚中的作用研究較少。另外，一氧化氮(nitric oxide，NO)已被證明除了參與壓力負(fù)荷型心肌肥厚的病理過程［8］，亦參與了糖尿病心肌肥厚的損傷過程［9］。作為多種信號通路的下游因子，PPARβ與NO的關(guān)系，尤其二者在糖尿病心肌肥厚中的作用，目前未見報(bào)道。

本研究擬利用高糖高胰島素(high glucose and insulin，HGI)模擬糖尿病時(shí)高糖血癥和高胰島素血癥環(huán)境，誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大［10］，對PPARβ及其與NO相關(guān)信號通路在糖尿病心肌肥大中的作用進(jìn)行相關(guān)研究。

材料和方法

1 動(dòng)物和主要試劑

清潔級，1～3日齡SD大鼠乳鼠由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2010－0001。

GW0742、GSK0660和5'－溴－2－脫氧尿嘧啶核苷(5'－bromo－2－deoxyuridine，5'－BrdU)均購自Sigma;胰蛋白酶、蛋白酶抑制劑、DMSO、RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自江蘇碧云天公司;DMEM和胎牛血清購自HyClone;NO含量測定試劑盒和總NO合酶(NO synthase，NOS)活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;Trizol購自大連寶生物公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green Supermix購自Bio－Rad;兔抗PPARβ多克隆抗體和兔抗iNOS多克隆抗體購自Cayman;PCR引物由Invitrogen公司負(fù)責(zé)合成和純化。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng)用胰蛋白酶消化法將乳鼠心室肌消化成單細(xì)胞懸液［10］，差速貼壁分離。將未貼壁心肌細(xì)胞用含20%胎牛血清的DMEM懸浮，調(diào)細(xì)胞密度分別接種于6孔板(1×108/L，檢測細(xì)胞表面積及總蛋白測定)或25 cm2培養(yǎng)瓶內(nèi)(1×109/L，mRNA提取及檢測)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。18～30 h后見細(xì)胞貼壁生長，48 h出現(xiàn)自發(fā)搏動(dòng)。培養(yǎng)初始48 h加入0.1 mmol/L 5'－BrdU抑制非心肌細(xì)胞生長。更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，至72 h換無血清培養(yǎng)液并加入相應(yīng)藥物，繼續(xù)孵育48 h后用于檢測。實(shí)驗(yàn)共分為4組，即:(1)正常對照(control)組:葡萄糖(5.5 mmol/L)+甘露醇(20.0 mmol/L); (2)HGI組:葡萄糖(25.5 mmol/L)+胰島素(0.1 μmol/L);(3)HGI+GW0742(1 μmol/L)組;(4) HGI+GW0742(1 μmol/L)+GSK0660(1 μmol/ L)組。

2.2 心肌細(xì)胞表面積測量取長有心肌細(xì)胞的玻片，PBS清洗3次后，相差顯微鏡下觀察拍照，應(yīng)用ImageJ 1.47v圖像分析系統(tǒng)測量單個(gè)細(xì)胞表面積。每張玻片取5個(gè)視野，每個(gè)視野檢測15～20個(gè)細(xì)胞，取平均值。每組重復(fù)3次。

2.3 心肌細(xì)胞總蛋白測定將6孔板內(nèi)培養(yǎng)好的心肌細(xì)胞用PBS清洗3次后，置于冰上加入RIPA裂解液，充分?jǐn)噭?dòng)裂解5 min，轉(zhuǎn)移至EP管，超聲破碎3 min，存放于－80℃。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，檢測總蛋白含量。每組重復(fù)3次。

2.4 Real－time PCR法檢測心房鈉尿因子(atrial natriuretic factor，ANF)、PPARβ和誘導(dǎo)型NOS(inducible NOS，iNOS)mRNA的表達(dá)參照GenBank中大鼠的基因序列，各引物序列見表1。用Trizol提取心肌細(xì)胞總RNA，按說明書操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用SYBR Green熒光技術(shù)，在Bio－Rad CFX96熒光定量PCR儀按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增:95℃30 s;95℃5 s，60℃30 s，40個(gè)循環(huán)。以β－actin為內(nèi)參照，Ct值為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，相對定量法分析結(jié)果。每組重復(fù)3次。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers

2.5 Western blotting法檢測PPARβ和iNOS蛋白的表達(dá)取30 μg總蛋白加入含β－巰基乙醇的上樣緩沖液，高溫煮沸10 min使蛋白變性，SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，BSA封閉1 h，加入不同I抗(均1∶1 000稀釋)，4℃過夜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗(1∶5 000稀釋)。洗膜后用發(fā)光液(Advanstor)顯色，凝膠成像儀與Image Lab軟件(Bio－Rad)照相顯影，分析結(jié)果。每組重復(fù)3次。

2.6 NOS活性檢測取培養(yǎng)上清液30 μL，按試劑盒說明書操作，在530 nm波長下測定吸光度(A值)。根據(jù)公式:總NOS活力(103U/L)=(總NOS活力測定管A－空白管A)×26.1/0.383×1.5，計(jì)算NOS活性。

2.7 NO含量檢測取培養(yǎng)上清液30 μL，硝酸還原酶法測定NO。按試劑盒說明書操作，在570 nm波長下測定A值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算NO含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用Excel和GraphPad Prism 5.01等軟件作圖。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較使用單因素方差分析。

結(jié)果

1 HGI誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大和GW0742的作用

HGI作用下，心肌細(xì)胞表面積、蛋白含量和ANF mRNA表達(dá)均明顯增加(P＜0.01)，提示心肌細(xì)胞肥大發(fā)生。若以平均值計(jì)算，HGI處理后，細(xì)胞表面積增加了3.5倍，蛋白含量增加了2.0倍，ANF的mRNA表達(dá)增加了3.8倍，見圖1、表2。

PPARβ特異性激動(dòng)劑GW0742(1 μmol/L)明顯抑制HGI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大(P＜0.05)，使HGI誘導(dǎo)增加的細(xì)胞表面積、蛋白含量和ANF的mRNA表達(dá)分別減少了54.6%、21.2%和31.3%。PPARβ阻斷劑GSK0660(1 μmol/L)完全阻斷了GW0742對HGI誘導(dǎo)心肌肥大的改善作用(P＜0.01)，各指標(biāo)基本恢復(fù)至HGI模型組水平，見圖1、表2。

Figure1.Themorphologicalchangesofcardiomyocytes (×200).圖1 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測

表2 HGI誘導(dǎo)心肌肥大和GW0742的作用Table 2.The effects of GW0742 on the hypertrophic cardiomyocytes induced by HGI(Mean±SD.n=3)

2 HGI對心肌細(xì)胞PPARβ、iNOS mRNA和蛋白表達(dá)的影響及GW0742的作用

在HGI作用下，PPARβ的mRNA和蛋白表達(dá)分別降低了8.2%和45.2%(P＜0.05)。iNOS的mRNA表達(dá)則增加了4.3倍(P＜0.01)，蛋白表達(dá)亦增加了1.1倍(P＜0.01)。GW0742(1 μmol/L)顯著逆轉(zhuǎn)HGI導(dǎo)致的PPARβ mRNA和蛋白表達(dá)降低(P＜0.01)，使PPARβ表達(dá)增加;同時(shí)明顯降低HGI上調(diào)的iNOS mRNA和蛋白表達(dá)(P＜0.01)。GSK0660(1 μmol/L)完全取消了GW0742的作用(P＜0.01)，使PPARβ和iNOS的表達(dá)均接近于HGI誘導(dǎo)時(shí)的水平，見圖2、圖3。

Figure 2.Effects of GW0742 on the mRNA(A)and protein(B)expression of PPARβ in the cardiomyocytes induced by HGI.Mean ±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs HGI;△△P＜0.01 vs HGI+GW0742.圖2 GW0742對HGI下調(diào)心肌細(xì)胞PPARβ mRNA和蛋白表達(dá)的作用

Figure 3.Effects of GW0742 on the mRNA(A)and protein(B)expressions of iNOS in the cardiomyocytes induced by HGI.Mean ±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs HGI;△△P＜0.01 vs HGI+GW0742.圖3 GW0742對HGI誘導(dǎo)心肌細(xì)胞iNOS mRNA和蛋白表達(dá)的影響

3 HGI對心肌細(xì)胞NOS活性及NO含量的影響及GW0742的作用

HGI作用使NOS的活性和NO的含量分別增加了31%和65%(P＜0.01)。GW0742(1 μmol/L)明顯降低了NOS的活性和NO的含量(P＜0.01)，使其基本恢復(fù)至正常水平。GSK0660(1 μmol/L)完全取消了GW0742的作用(P＜0.01)，使NOS活性和NO含量均接近于HGI誘導(dǎo)時(shí)的水平。

Figure 4.Effects of GW0742 on the NOS activity(A)and NO concentration(B)in the cardiomyocytes induced by HGI.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs HGI;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs HGI+GW0742.圖4 GW0742對HGI誘導(dǎo)心肌細(xì)胞NOS活性和NO含量的作用

討論

心肌肥厚是2型糖尿病患者常見的心血管并發(fā)癥，是DCM的重要特征之一，也是糖尿病病人心血管并發(fā)癥死亡常見的病理基礎(chǔ)，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)已證實(shí)，高血糖和高胰島素可作為獨(dú)立因素參與心肌肥厚的形成［11－12］。本實(shí)驗(yàn)采用葡萄糖25.5 mmol/L和胰島素0.1 μmol/L模擬糖尿病時(shí)高糖高胰島素血癥環(huán)境，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞表面積、總蛋白含量和心肌肥厚標(biāo)志因子ANFmRNA的表達(dá)均明顯增加，提示糖尿病心肌細(xì)胞肥大模型建立成功。

近年研究發(fā)現(xiàn)，PPARs家族在代謝性疾病中具有重要的調(diào)節(jié)作用。PPARβ參與細(xì)胞的能量代謝、脂質(zhì)調(diào)節(jié)和葡萄糖的利用，維持機(jī)體能量平衡。PPARβ可促進(jìn)PPARγ輔激活因子－1α表達(dá)，從而增加脂肪酸β氧化，加強(qiáng)肌肉組織中線粒體呼吸鏈的活性，消耗能量，并改善胰島素敏感性［13］。在PPARβ基因敲除小鼠給予高脂飲食體重增加更明顯，而PPARβ轉(zhuǎn)基因小鼠則可減少肥胖發(fā)生和脂肪累積。另外，PPARβ可誘導(dǎo)高密度脂蛋白(high－density lipoprotein，HDL)生成，增加HDL水平［14］。PPARβ激動(dòng)劑GW501516/GW1516、GW0742和L－165041均可增加高密度脂蛋白膽固醇，降低低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯，改善肥胖動(dòng)物的血脂水平［15－16］。這些結(jié)果顯示，PPARβ參與了能量代謝和脂質(zhì)調(diào)節(jié)，在糖尿病心肌肥厚中可能有重要作用。本研究結(jié)果顯示，在HGI誘導(dǎo)肥大的心肌細(xì)胞，PPARβ mRNA和蛋白表達(dá)明顯下降;PPARβ選擇性激動(dòng)劑GW0742改善HGI作用同時(shí)，明顯上調(diào)PPARβ mRNA和蛋白的表達(dá)，提示糖尿病心肌肥大的發(fā)生與PPARβ表達(dá)的下調(diào)可能有直接關(guān)系。利用PPARβ選擇性阻斷劑GSK0660進(jìn)一步研究顯示，GSK0660可完全阻斷GW0742對HGI誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的改善作用，PPARβ mRNA和蛋白的表達(dá)降至HGI模型組水平。該結(jié)果從另一個(gè)方面再次證實(shí)PPARβ相關(guān)信號通路在糖尿病心肌肥大病理生理發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。

NO是心血管系統(tǒng)關(guān)鍵的信號分子之一［17］。大量研究顯示，在DCM中，NO與NOS參與了氧化應(yīng)激、炎癥、高血壓、高膽固醇血癥等多種心血管疾病有關(guān)的病理過程［18］。正常情況下，心肌細(xì)胞通過內(nèi)皮型NOS合成少量NO來維持生理功能。當(dāng)受到內(nèi)毒素、細(xì)胞因子等刺激后則表達(dá)iNOS，大量合成NO，參與病理過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HGI誘導(dǎo)心肌肥大同時(shí)，iNOS在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯增加，總NOS活性亦增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量明顯上升，提示iNOS－NO可能也參與了糖尿病心肌肥大的損傷過程?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，PPARβ激活對腦梗塞大鼠的保護(hù)作用和對糖尿病內(nèi)皮損傷的改善作用，都與其降低iNOS活性和NO含量有關(guān)［4，17］，提示NO可能是PPARβ的下游效應(yīng)因子。本實(shí)驗(yàn)中，給予PPARβ激動(dòng)劑GW0742后，心肌肥大改善，PPARβ表達(dá)上調(diào);同時(shí)，iNOS的表達(dá)、NOS活性及NO含量均恢復(fù)至正常水平;PPARβ阻斷劑GSK0660完全取消GW0742對心肌肥大的改善作用，下調(diào)PPARβ表達(dá)，同時(shí)亦阻斷GW0742對iNOS－NO通路的調(diào)控。這些結(jié)果提示，在糖尿病心肌肥大，可能存在PPARβ－iNOS－NO信號調(diào)控系統(tǒng)。

綜上所述，在高糖高胰島素環(huán)境下，PPARβ受體表達(dá)下調(diào)，iNOS－NO通路激活，最終導(dǎo)致心肌肥大。我們以前的研究證實(shí)，PPARα和PPARγ也參與了糖尿病心肌肥厚的病理過程［10，19］，提示PPARs家族在糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。但該過程是否還有其它信號通路參與，需要進(jìn)行更多深入研究。

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Effects of PPARβ and NO on high glucose and insulin-induced cardiomyocyte hypertrophy

HUANG Bo，WU Yang，XUE Lai，PENG Yi－fei，QIU Hong－mei，JIANG Qing－song

(Department of Pharmacology，Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China.E-mail:cqjiangqs@hotmail.com)

AIM:To investigate the role of peroxisome proliferator－activated receptor β(PPARβ)－nitric oxide (NO)signal pathway in cardiomyocyte hypertrophy induced by high glucose(25.5 mmol/L)and insulin(0.1 μmol/L) (HGI).METHODS:The cardiomyocyte hypertrophy was characterized in rat primary cardiomyocytes by measuring the cell surface area，protein content，and the mRNA expression of atrial natriuretic factor(ANF).The mRNA and protein expression were measured by real－time PCR and Western blotting，respectively.The activity of NO synthase(NOS)and NO content were measured by a reagent kit through ultraviolet spectroscopy.RESULTS:HGI induced profound change of hypertrophic morphology，and significantly increased the cell surface area，protein content and mRNA expression of ANF (P＜0.01)，but decreased the expression of PPARβ at mRNA and protein levels(P＜0.05).At the same time，the expression of inducible NOS(iNOS)was obviously elevated(P＜0.01)，which occurred in parallel with the rising NOS activity and NO concentration(P＜0.01).GW0742(1 μmol/L)，a selective PPARβ agonist，inhibited the cardiomyocyte hypertrophy induced by HGI(P＜0.01)，and up－regulated the expression of PPARβ at both mRNA and protein levels.Meanwhile，GW0742 also inhibited the increases in iNOS expression，NOS activity，and NO content induced by HGI，which were abolished by GSK0660(1 μmol/L)，a selective PPARβ antagonist(P＜0.01).CONCLUSION:PPARβ down－regulation and the following iNOS－NO activation are involved in the cardiomyocyte hypertrophy induced by HGI.

Peroxisome proliferator－activated receptor β;Inducible nitric oxide synthase;Nitric oxide;Myocardial hypertrophy;High glucose and insulin

R363;R587.1

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.013

1000－4718(2015)02－261－06

2014－09－19

2014－10－22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81100905)

△通訊作者Tel:023－68485161;E－mail:cqjiangqs@hotmail.com