楊永曜，楊天和，蔣清安，楊龍，唐峰，譚洪文

(貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽 550002)

抑制肌球蛋白輕鏈激酶活性對內(nèi)皮素-1誘導的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖及凋亡失衡的影響*

楊永曜，楊天和△，蔣清安，楊龍，唐峰，譚洪文

(貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴州 貴陽 550002)

目的:觀察抑制肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)對內(nèi)皮素－1(ET－1)誘導的大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增殖與凋亡失衡的影響。方法:細胞分成3組:對照組;內(nèi)皮素－1組;內(nèi)皮素－1+肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑組(ET－1+M組)。干預72 h后，免疫印跡法測定細胞內(nèi)MLCK表達水平;甘油凝膠電泳和免疫印跡法檢測肌球蛋白輕鏈(MLC)的磷酸化水平，MTT比色法及［3H］－TdR摻入法檢測PASMCs的增殖情況，流式細胞儀檢測PASMCs的細胞周期變化及凋亡率。結(jié)果:同對照組比較，ET－1刺激后肺動脈平滑肌細胞MLCK蛋白表達顯著增強、MLC磷酸化上調(diào)、增殖增多、凋亡率明顯降低(均P＜0.05);加入MLCK抑制劑干預后，MLCK表達明顯下降(P＜0.05)、MLC去磷酸化顯著增強、逆轉(zhuǎn)了ET－1對PASMCs增殖及凋亡的影響。結(jié)論:抑制MLCK能顯著逆轉(zhuǎn)內(nèi)皮素－1誘導的大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖與凋亡的失衡。

肌球蛋白輕鏈激酶;內(nèi)皮素－1;肺動脈平滑肌細胞;細胞增殖;細胞凋亡

目前已知肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)的病理學基礎(chǔ)是通過肺血管收縮和肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)兩個基本的機制使肺血管阻力增加，在早期肺血管收縮中起主要作用，后期則以肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)為主［1］。內(nèi)皮素(endothelin，ET)作為一種強烈的促進細胞增殖的啟動生長因子，使肺血管平滑肌細胞增生肥厚，促進血管壁的增生和狹窄;因此ET在PAH的肺血管張力的維持和肺血管重構(gòu)方面均起重要作用［2］。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)是僅知的催化不同Ca2+/CaM依賴性肌球蛋白II輕鏈磷酸化的一種蛋白激酶，是平滑肌收縮最重要的限速因子。但MLCK在肺動脈高壓血管重構(gòu)中的地位和作用尚缺乏重視和研究。

本研究擬從細胞及分子水平驗證抑制肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化的鈣依賴途徑MLCK對ET－1誘導的大鼠肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs)增殖與凋亡失衡的影響。

材料和方法

1 主要試劑和材料

胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶III型(Hyclone);二甲基亞砜(DMSO)、I型膠原酶、小鼠抗MLCK單克隆抗體、小鼠抗MLC單克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標記的II抗(Sigma);小鼠抗大鼠α－actin抗體(武漢博士德公司);FITC標記山羊抗小鼠抗體(中杉公司);MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司);［3H］－TdR(上海原子能研究所);ET－1(Bachem); MLCK抑制劑ML－7(Calbiochem);Kodak 4400CF圖像分析系統(tǒng)(PELS)。其余試劑均為國產(chǎn)試劑。

2 大鼠肺動脈平滑肌細胞的培養(yǎng)、鑒定與分組

［3］對大鼠肺動脈平滑肌細胞進行原代培養(yǎng)、純化和鑒定，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，接種于新培養(yǎng)瓶擴大培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)后改用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，倒置相差顯微鏡下觀察，細胞呈典型“谷”、“峰”狀生長。培養(yǎng)出的細胞用α－actin免疫組化鑒定，實驗應用第3～5代細胞。

當傳代的細胞生長到70%～80%融合，以無血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)液，繼續(xù)同步化培養(yǎng)24 h。采用隨機排列表法將細胞分為3組:①對照組(control組)培養(yǎng)液中只加DMSO，不加ET－1(為使實驗條件一致，各組均同樣要加入DMSO，終濃度為0.1%)，繼續(xù)培養(yǎng)72 h;②內(nèi)皮素－1組(ET－1組)干預前均預先給予1%胎牛血清饑餓24 h，再加入10－8mol/L的ET－1刺激;③ET－1+肌球蛋白輕鏈激酶抑制劑組(ET－1+M組)以MLCK特異性抑制劑ML－7 20 μmol/L在ET－1加入前預處理細胞30 min，72 h后收獲細胞，檢測各項指標。

3 主要實驗方法

3.1 MLC磷酸化的測定按參考文獻［4］方法，用甘油凝膠電泳和免疫印跡法檢測肌球蛋白輕鏈的磷酸化水平。MLC磷酸化水平以磷酸化MLC(p－MLC)與總MLC比值(%)表示。

3.2 Western blotting檢測蛋白水平收集細胞加入4℃預冷的細胞裂解液提取總蛋白，Bradford法測定蛋白濃度后各取等量蛋白上樣，12%SDS－PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用小鼠抗MLCK單克隆抗體(1∶1 000)作為Ⅰ抗于4℃孵育過夜，洗膜，加HRP標記的Ⅱ抗(1∶5 000)常溫孵育60 min，以增強化學發(fā)光法顯色、曝光，定量測定各條帶密度，以內(nèi)參照蛋白β－actin進行校正。

3.3 MTT比色法測定PASMCs的增殖參考文獻方法［3］，于酶標儀測570 nm處吸光度值(A)，每孔A值減去空白孔A值為測試孔A的真值。

3.4 ［3H］－TdR摻入法檢測細胞的DNA合成應用［3H］thymidine試劑盒檢測細胞增殖［3］。以液體閃爍計數(shù)器測定每分鐘的脈沖數(shù)(counts per minute，CPM)反映細胞內(nèi)DNA的合成。

3.5 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率參考文獻方法［5］，收集培養(yǎng)瓶中的各組平滑肌肌細胞加入5 μL Annexin V－FITC和10 μL 20 mg/L的PI溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min(試劑盒購自深圳晶美生物公司)。在反應管中加入400 μL PBS，應用流式細胞儀(Beckman Counter)檢測細胞周期分布及定量分析凋亡細胞百分率。

4 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析(one－way ANOVA)分析，各組兩兩比較用Newman－Keuls檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 內(nèi)皮素－1對MLCK表達的的影響

倒置顯微鏡下大鼠PASMCs呈“谷”、“峰”狀生長，特異性兔抗鼠α－actin單克隆抗體免疫熒光鑒定可見排列的束狀肌絲被染成紅色，證明培養(yǎng)細胞為平滑肌細胞，見圖1。在PASMCs內(nèi)MLCK(分子量210 kD)表達變化的定量分析結(jié)果表明，ET－1組與正常對照組比較，MLCK表達顯著上升(P＜0.05);而ET－1+M組較ET－1組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義，見圖2。

Figure 1.Identification of the rat PASMCs.A:the typical“hill and valley”appearance;B:α－smooth muscle actin positiveexpression(immunofluorescencestaining，×200).圖1 大鼠肺動脈血管平滑肌細胞的鑒定

Figure 2.The protein expression of MLCK in rat PASMCs determined by Western blotting.Mean±SD.n=4.*P＜0.05 vs control group;#P＜0.05 vs ET－1 group.圖2 各組大鼠PASMCs中MLCK蛋白表達的比較

2 抑制MLCK對MLC磷酸化的影響

用ET－1刺激PASMCs后，PASMCs的MLC磷酸化水平明顯升高(P＜0.01)，ML－7預處理可拮抗ET－1升高MLC磷酸化水平的作用(P＜0.01)，見圖3。

3 MLCK抑制對ET-1刺激的PASMCs增殖的影響

ET－1組與正常對照組相比增殖活性有顯著性差異(P＜0.05)，提示ET－1可以使PASMCs增殖能力增強;而予MLCK抑制劑ML－7預處理后相對ET－1組，增殖活性顯著降低(P＜0.05)。提示MLCK抑制后，ET－1刺激的PASMCs增殖反應受到明顯抑制，見表1。

Figure 3.The influence of MLCK inhibition on MLC phosphorylation in rat PASMCs.Mean±SD.n=4.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs ET－1 group.圖3 抑制MLC對大鼠PASMCs的MLCK磷酸化的影響

表1 抑制MLCK活性對對ET-1刺激PASMCs增殖反應的影響Table 1.The effect of inhibiting myosin light chain kinase on the proliferation of ET－1－induced PASMCs(Mean±SD.n=5)

4 MLCK抑制對ET-1刺激PASMCs后細胞周期的影響

相對正常對照組，ET－1刺激可使G0/G1期(靜止期)細胞比例顯著降低，S+G2/M期(DNA合成期+有絲分裂期)細胞比例顯著增加(均P＜0.05)，提示ET－1可促進PASMCs有絲分裂進入增殖期，而ET－1+M組與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)。提示抑制MLCK信號途徑能抑制ET－1導致的PASMCs增殖，見圖4、表2。

5 MLCK抑制對ET-1介導的PASMCs凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測可見，與對照組比較，ET－1刺激后PASMCs凋亡率顯著下降(P＜0.05);而ET－1+M組的細胞凋亡率相對ET－1組升高(P＜0.01)，見圖5。

Figure 4.Flow Cytometry analysis of PASMCs.圖4 增殖流式細胞圖

表2 MLCK抑制對ET-1刺激PASMCs后細胞周期的影響Table 2.The effect of inhibiting myosin light chain kinase on the stimulation with ET－1(Mean±SD.n=5)

Figure 5.The flow cytometry analysis scatterplot of the PASMCs with Annexin V－FITC/PI double staining.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control group;##P＜0.01 vs ET－1 group.圖5 流式細胞術(shù)檢測PASMCs的Annexin V-FITC/PI檢測結(jié)果

討論

肺動脈高壓中肺血管平滑肌的收縮及重構(gòu)是其中心環(huán)節(jié)，在平滑肌的收縮過程中，MLC磷酸化水平是決定肌肉收縮程度及一系列細胞反應的一個重要因素，Ca2+依賴性的MLC磷酸化對組織細胞的收縮、移動非常重要。有充分的證據(jù)表明，MLC除磷酸化發(fā)揮收縮效應外，還介導了一系列細胞生物學反應如遷移、增殖、凋亡等［6］。另外有研究通過基因干擾比較MLCK和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)對MLC的作用，證實了MLCK在血管平滑肌MLC磷酸化中的核心地位，還發(fā)現(xiàn)MLCK的活化促進了平滑肌的遷移［7］。目前的綜述也闡明了Ca2+依賴途徑的MLCK通過對MLC磷酸化的平衡調(diào)節(jié)，誘導血管平滑肌的舒縮，對各種微血管功能障礙性疾病如缺血－再灌注損傷、動脈粥樣硬化及糖尿病等的內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)起了重要的作用，該途徑中心是MLCK［8］。最新的國內(nèi)文獻［9］通過采用慢病毒轉(zhuǎn)染方式上調(diào)或下調(diào)大鼠肺血管平滑肌細胞表達MLCK水平，發(fā)現(xiàn)MLCK促進肺血管平滑肌細胞增殖，可能是通過促進內(nèi)皮素受體實現(xiàn)，支持MLCK對血管平滑肌增殖的調(diào)節(jié)作用。然而，盡管MLCK在平滑肌收縮研究中已得到充分研究，但其在平滑肌增殖及凋亡中的作用至今仍尚少見報導。

本實驗通過觀察ET－1對大鼠肺動脈平滑肌的影響，首先發(fā)現(xiàn)ET－1刺激肺動脈平滑肌細胞后MLCK蛋白表達顯著增強，MLC磷酸化上調(diào)，通過MTT法及［3H］－TdR摻入法證明PASMCs增殖顯著;而我們已知細胞周期進程中G1期向S期轉(zhuǎn)化是細胞增殖調(diào)控的重要節(jié)點，一旦細胞越過G1晚期，則不可逆地進入細胞周期并進行DNA復制［10］，本研究進一步通過流式細胞儀檢測了細胞周期及凋亡率，發(fā)現(xiàn)ET－1抑制了PASMCs凋亡，與以往研究基本相符［11］。研究發(fā)現(xiàn)缺氧增加ET－1等細胞因子活性，而ET－1可激活血管平滑肌RhoA［12］，故推測MLC磷酸化非Ca2+依賴的Rho/Rho激酶信號通過調(diào)節(jié)肺血管對ET等的反應引起肺血管重構(gòu)。有實驗也證實慢性缺氧PAH大鼠肺動脈環(huán)對ET的收縮反應是依賴Rho/Rho激酶和酪氨酸激酶而非PKC信號通路［13］。但在肺動脈高壓PASMCs重構(gòu)進程中ET－1與MLCK的關(guān)系缺乏研究，本研究從細胞層面證實了ET－1也通過MLCK信號途徑起作用。MLCK途徑是一個Ca2+→CaM→MLCK→MLC的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)，該途徑的中心環(huán)節(jié)是MLCK，CaM與Ca2+結(jié)合后，能激活MLCK，導致MLC第19位絲氨酸磷酸化，進而肌球蛋白ATP酶活化，平滑肌收縮。Ca2+濃度下降使MLCK失活，MLCP使19位絲氨酸脫磷酸化，ATP酶失活，平滑肌舒張［14］。本研究證實在肺動脈平滑肌重構(gòu)中Ca2+依賴途徑的MLCK也起了重要作用，發(fā)現(xiàn)在細胞和分子水平，抑制MLCK信號途徑后，MLC磷酸化程度顯著下降同時，也抑制了ET－1誘導的PASMCs增殖，同時促進PASMCs凋亡。

可見通過對MLCK的抑制，能調(diào)節(jié)PASMCs的細胞周期及凋亡率，逆轉(zhuǎn)了ET－1刺激對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖與凋亡失衡的影響，提示MLCK在肺動脈高壓肺血管重構(gòu)過程中可能發(fā)揮了重要作用，可望成為肺動脈高壓基因治療的新靶點。

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Effects of inhibiting myosin light chain kinase on endothelin-1 induced proliferation and apoptosis of pulmonary arterial smooth muscle cells in rats

YANG Yong－yao，YANG Tian－h(huán)e，JIANG Qing－an，YANG Long，TANG Feng，TAN Hong－wen

(Department of Cardiology，Guizhou Provincial People’s Hospital，Guiyang 550002，China.E-mail:yangyy19@hotmail.com)

AIM:To investigate the effect of inhibiting myosin light chain kinase(MLCK)on endothelin－1 (ET－1)induced proliferation and apoptosis of rat pulmonary artery smooth muscle cells(PASMCs).METHODS:Rat PASMCs were cultured and stimulated with ET－1.The cells were randomly divided into control group，ET－1 group and ET－1+MLCK inhibitor group(ET－1+M).Western blotting，MTT assay，［3H］－TdR incorporation and flow cytometry were employed to test the expression of myosin light chain(MLC)and MLCK，cell proliferation，cell cycle and apoptotic rate of PASMCs，respectively.The phosphorylation of MLC was determined by glycerol－PAGE coupled with Western blotting.RESULTS:Compared with control group，the protein expression of MLCK and MLC phosphorylation significantly enhanced after ET－1 stimulation.ET－1 markedly induced the proliferation and decreased the percentage of apoptotic rate in the PASMCs.However，pretreatment with ML－7，a MLCK inhibitor，significantly reversed the above effects induced by ET－1.CONCLUSION:MLCK inhibitor effectively inhibits the ET－1－induced proliferation and the cell cycle progression.

Myosin light chain kinase;Endothelin－1;Pulmonary artery smooth muscle cells;Cell proliferation;Apoptosis

R363;R393

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.012

1000－4718(2015)02－256－05

2014－08－26

2014－10－28

貴州省科技攻關(guān)項目(黔科合SY字［2008］3065號);貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長資金(黔省專合字［2009］

33號)

△通訊作者Tel:0851－5922979;E－mail:yangyy19@hotmail.com