崔宇，官立彬，李曉栩，楊誠(chéng)忠，譚小玲，高鈺琪，黃瑊△

(第三軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系1高原生理學(xué)與高原生物學(xué)教研室，2高原特需藥品與裝備研究室，高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，全軍高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

低氧促進(jìn)Th17細(xì)胞浸潤(rùn)于肺組織并與肺血管改建相關(guān)*

崔宇1，官立彬1，李曉栩1，楊誠(chéng)忠1，譚小玲1，高鈺琪2，黃瑊1△

(第三軍醫(yī)大學(xué)高原軍事醫(yī)學(xué)系1高原生理學(xué)與高原生物學(xué)教研室，2高原特需藥品與裝備研究室，高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，全軍高原醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400038)

目的:觀察低壓低氧時(shí)肺組織中維甲酸相關(guān)孤兒受體(ROR)γt的mRNA表達(dá)水平及白細(xì)胞介素17(IL－17)水平的變化，探討Th17細(xì)胞與缺氧肺血管改建的關(guān)系。方法:50只雄性BALB/c小鼠按低氧時(shí)間隨機(jī)分為0 d、3 d、7 d、14 d和28 d組，每組10只。低壓低氧組小鼠均置入模擬海拔6 000 m的低壓艙內(nèi)飼養(yǎng)3 d、7 d、14 d和28 d。常氧組置常壓常氧環(huán)境下飼養(yǎng)(即0 d組)。于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)通過(guò)心導(dǎo)管檢測(cè)右室收縮壓，隨后快速處死取材，測(cè)量右心室重量指數(shù)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟組織Th17細(xì)胞(CD4+IL－17+RORγt+)的比例，用ELISA法檢測(cè)血清中IL－4、IL－6、IL－17水平及肺組織中IL－17水平，采用real－time PCR法檢測(cè)肺組織RORγt的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果:與對(duì)照組(0 d組)相比，低壓低氧7 d、14 d和28 d組小鼠右心室收縮壓力、右心肥厚指數(shù)和血清IL－17含量均升高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);脾臟組織中IL－17+RORγt+CD4+T細(xì)胞的百分比隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，14 d和28 d組與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.01);7 d、14 d和28 d組肺組織中RORγt的mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);14 d和28 d組肺組織中IL－17水平與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.01)。肺組織中RORγt的mRNA表達(dá)水平、IL－17表達(dá)量與心室收縮壓、右室肥厚指數(shù)呈顯著正相關(guān)。結(jié)論:低壓低氧促進(jìn)脾臟T0細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，肺組織中RORγt的mRNA表達(dá)水平及IL－17水平顯著升高，提示Th17細(xì)胞可能參與缺氧性肺動(dòng)脈高壓及肺血管改建的發(fā)生。

Th17細(xì)胞;維甲酸相關(guān)孤兒受體γt;白細(xì)胞介素17;缺氧性肺動(dòng)脈高壓

低氧是一種常見(jiàn)的應(yīng)激和損傷因素，可誘發(fā)體內(nèi)多系統(tǒng)功能改變，引起多種疾病，威脅人體健康。缺氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxia pulmonary hypertension，HPH)是由低氧引起的以持續(xù)肺動(dòng)脈壓力增高、肺血管結(jié)構(gòu)改建，并伴有右心室肥大的慢性進(jìn)行性疾病，是肺源性心臟病、高原心臟病等發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。HPH的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，炎癥免疫反應(yīng)在其中發(fā)揮著重要作用［1－5］。缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia－inducible factors，HIFs)是介導(dǎo)缺氧性肺血管改建等多種低氧反應(yīng)的氧感知信號(hào)途徑中的關(guān)鍵分子［6］。Dang等［7］在體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型研究發(fā)現(xiàn)，HIF－1上調(diào)與激活可促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化，抑制其向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)分化。HIF－1可直接激活Th17細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤兒受體γt(retinoid－related orphan receptor γt，RORγt)，并可與RORγt協(xié)同調(diào)控Th17的功能。Th17細(xì)胞是一種擁有獨(dú)立分化機(jī)制的新型CD4+效應(yīng)T細(xì)胞［8］，在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)、哮喘等慢性炎癥性疾病和多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［9－10］。有關(guān)Th17細(xì)胞在低氧性肺血管改建及HPH發(fā)生中的作用及機(jī)制，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討低壓低氧暴露后Th17細(xì)胞的變化特點(diǎn)及其與肺血管改建之間的關(guān)系，以深入揭示HPH的發(fā)病機(jī)制，并為尋求有效的防治靶點(diǎn)提供線索和依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

12周齡雄性BALB/c小鼠50只由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，按體質(zhì)量采用隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為5組，分別在低氧環(huán)境暴露不同的時(shí)間:0 d (平原組)、3 d、7 d、14 d和28 d組，各組10只小鼠。平原組常壓常氧下飼養(yǎng)，低壓低氧組置于低壓艙內(nèi)(模擬海拔6 000 m)飼養(yǎng)3 d、7 d、14 d和28 d。動(dòng)物常規(guī)分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。

2 檢測(cè)方法

2.1 小鼠心功能及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測(cè)定以10%氨基甲酸乙酯(烏拉坦，1 mL/100 g)腹腔麻醉，動(dòng)物仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)右頸外靜脈插入心導(dǎo)管至右心室，用PowerLab/8SP多導(dǎo)生理記錄儀(AD)檢測(cè)右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)等心功能及血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。

2.2 右心肥厚指數(shù)測(cè)定檢測(cè)完血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)后處死小鼠，完整取出心臟，剪去心房組織，沿室間隔邊緣剪下右心室，用生理鹽水將血沖洗干凈后，用濾紙吸干水分，稱(chēng)取右心室(right ventricle，RV)、左心室(left ventricle，LV)和室間膈(interventricular septum，S)重量，并計(jì)算RV/(LV+S)比值，即右室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)。2.3細(xì)胞因子檢測(cè)眼球取血法取血，制備血清，采用ELISA法測(cè)定血清IL－4、IL－6和IL－17細(xì)胞因子含量(IL－4和IL－6 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，IL－17 ELISA試劑盒購(gòu)自Raybiotech)。2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real－time PCR)提取脾臟組織總RNA(Omega總RNA提取試劑盒)，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄RNA，PCR使用SYBR Green real－time PCR試劑盒(TaKaRa)，RORγt的上游引物為5’－TGA GAA GGA CAG GGA GCC AA－3’，下游引物為5’－CCA CAG ATT TTG CAA GGG ATC A－3’;內(nèi)參照β－actin的上游引物為5’－GCC CTA GAC TTC GAG C－3’，下游引物為5’－CTT TAC GGA TGT CAA CGT－3’。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)將動(dòng)物脾臟放置在70 μm尼龍網(wǎng)(Corning)上碾磨后加入4 mL紅細(xì)胞裂解液，制備脾臟單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液移至15 mL離心管，加入RPMI 1640培養(yǎng)基至15 mL后，1 800 r/min離心6 min，棄上清。加入flow cytometry staining buffer(BD)5 mL，300×g離心6 min，每mL加入cell stimulation cooktail(Ebioscience)2 μL，37℃孵育4 h。加入小鼠CD4 PE－Cy5抗體，冰上避光孵育30min，后加入Foxp3 Fixation/Permeabilization(BD)1 mL破膜/固定，室溫孵育60 min，加2 mL 1×permeabilization buffer，400×g離心5 min，棄上清。100 μL 1×permeabilization buffer重懸后加入2 μL小鼠血清室溫孵育15 min，不清洗，加入IL－17 APCCy7和RORγt PE抗體，冰上孵育30 min。每孔加入2 mL 1×permeabilization buffer，400×g離心5 min，棄上清，用適量flow cytometry staining buffer重懸，上機(jī)檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 右心室收縮壓及右心室肥厚指數(shù)的變化

肺血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，7 d、14 d和28 d組小鼠RVSP和右心肥厚指數(shù)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Hemodynamic changes of the mice under hypoxia.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖1 缺氧對(duì)小鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的影響

2 低壓低氧后小鼠血清細(xì)胞因子的變化

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，低壓低氧后各組小鼠血清IL－4水平較對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低壓低氧7 d、14 d和28 d組血清的IL－17水平與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.01)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The changes of the serum cytokine levels in BALB/c mice after hypobaric hypoxia exposure.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖2 低壓低氧后小鼠血清細(xì)胞因子的變化

3 脾臟Th17細(xì)胞比例的變化

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在低氧誘導(dǎo)下，脾臟組織中IL－17+RORγt+CD+T細(xì)胞百分比隨缺氧時(shí)間的增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，14 d和28 d組與對(duì)照組比較差異顯著(P＜0.01)，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The change of spleen Th17 cell proportion in BALB/c mice after hypobaric hypoxia exposure.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖3 低壓低氧對(duì)小鼠脾臟Th17細(xì)胞的影響

4 肺組織RORγt的mRNA水平

Real－time PCR結(jié)果顯示，在低氧誘導(dǎo)下，肺組織中RORγt的mRNA表達(dá)明顯升高，7 d、14 d和28 d組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The mRNA expression of RORγt in the lung tissue of BALB/c mice after hypobaric hypoxia exposure.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖4 低壓低氧對(duì)小鼠肺組織RORγt mRNA表達(dá)的影響

5 肺組織IL-17水平

ELISA結(jié)果顯示，14 d和28 d組肺組織中IL－17水平與對(duì)照組相比顯著升高(P＜0.01)，見(jiàn)圖5。

Figure 5.The levels of IL－17 in the lung tissue of BALB/c mice after hypobaric hypoxia exposure.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖5 低壓低氧對(duì)小鼠肺組織IL-17水平的影響

6 相關(guān)性分析

在低壓缺氧7 d時(shí)，RVSP與血清IL－17水平呈正相關(guān);在低壓缺氧14 d時(shí)，RVSP與肺組織IL－17水平呈正相關(guān)，RV/(LV+S)與肺組織IL－17水平呈正相關(guān);此外，在低壓缺氧7 d及14 d時(shí)肺組織RORγt mRNA水平與RVSP有相關(guān)性，且呈正相關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 Th17濃度與RVSP、RVHI、RORγt之間的相關(guān)系數(shù)Table 1.The correlation coefficients between serum Th17 concentration and RVSP，RVHI and RORγt

討論

HPH是高原心臟病發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而高原心臟病是高原上的常見(jiàn)疾病，是慢性高原病患者重要的死亡原因。由于對(duì)HPH的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，迄今尚缺乏有效的防治措施。以往研究顯示，炎癥免疫反應(yīng)在HPH的發(fā)生中具有重要作用，但具體機(jī)制尚不清楚。HPH的病理生理學(xué)特征是持續(xù)的肺血管收縮與肺血管機(jī)構(gòu)改建，進(jìn)而引起右心后負(fù)荷增加，右心室肥大。本研究采用低壓低氧暴露復(fù)制小鼠HPH模型，結(jié)果顯示，低氧各組小鼠右心室收縮壓和右心室肥厚指數(shù)均顯著高于常氧組，表明模型復(fù)制成功。利用該動(dòng)物模型，我們進(jìn)而研究了Th17細(xì)胞在HPH發(fā)生發(fā)展中的作用。

低氧可以通過(guò)多種途徑導(dǎo)致肺血管舒縮平衡失調(diào)、內(nèi)膜增厚、中層平滑肌增生肥大并向遠(yuǎn)端小血管延伸、中層與外膜層間質(zhì)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)增多，同時(shí)肺小血管肌化程度增強(qiáng)、非肌型動(dòng)脈肌型化以及細(xì)胞外基質(zhì)沉淀增多等，最終導(dǎo)致血管重構(gòu)(vascular remodeling)和肺動(dòng)脈高壓［11］。這些病理變化與單核巨噬細(xì)胞、纖維細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)有關(guān)［12］。

Th17細(xì)胞在炎癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮十分重要的作用。Th17細(xì)胞的發(fā)育與功能不同于Th1和Th2細(xì)胞系，RORγt是Th17細(xì)胞系的特異性轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)Th0細(xì)胞分化成熟為T(mén)h17細(xì)胞，促進(jìn)IL－17、IL－17F和IL－23R的產(chǎn)生。此外Th17細(xì)胞還能夠分泌產(chǎn)生IL－6等促炎因子，IL－17作為其主要的效應(yīng)因子，能募集及活化中性粒細(xì)胞［13］，促進(jìn)T細(xì)胞活化及刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而介導(dǎo)組織炎癥反應(yīng)［14－15］。聶穎等［16］研究發(fā)現(xiàn)PI3K信號(hào)通路對(duì)于調(diào)控Th17細(xì)胞的分化有重要作用。肝癌患者瘤內(nèi)Th17細(xì)胞百分比與微血管密度呈正相關(guān)［17］，IL－17還能促進(jìn)新生血管的生成［18－19］。Semik等［20］研究發(fā)現(xiàn)IL－17與COPD患者氣道平滑肌增生程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)IL－17能通過(guò)增加膠原蛋白沉積，刺激纖維細(xì)胞與成纖維細(xì)胞增殖［21］。

RORγt可作為初始T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的依據(jù)。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脾臟組織中RORγt mRNA水平在低壓低氧3 d時(shí)顯著升高，RORγt與IL－17雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也顯著增多。在低壓低氧7 d、14 d和28 d時(shí)小鼠外周血IL－17含量也顯著增高;可以說(shuō)明在低氧早期就可以誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向著Th17細(xì)胞分化，并導(dǎo)致血清IL－17含量增多。

本研究發(fā)現(xiàn)，低壓低氧各組肺組織中RORγt的mRNA水平均顯著高于常氧組，肺組織中IL－17水平與常氧組相比也顯著升高。結(jié)果表明，低壓低氧后，Th17細(xì)胞在肺組織中增多，導(dǎo)致肺組織IL－17水平增高，IL－17可以刺激上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1等黏附分子［22］，并能增強(qiáng)VEGF、bFGF等生長(zhǎng)因子的促增殖作用［23］，共同參與肺血管改建。通過(guò)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，肺組織中的RORγt mRNA、IL－17水平均與右室收縮壓、右心室肥厚指數(shù)顯著正相關(guān)，這一結(jié)果提示Th17細(xì)胞在肺血管與心肌結(jié)構(gòu)改建中發(fā)揮重要作用。低壓低氧后肺部Th17數(shù)量增強(qiáng)除了與來(lái)自于脾臟分化成熟的Th17細(xì)胞之外，還可能與肺部某些細(xì)胞分化為T(mén)h17有關(guān)。

本研究結(jié)果提示，Th17細(xì)胞可能在低壓低氧肺血管改建中發(fā)揮重要作用。針對(duì)性適時(shí)控制Th17的分化、趨化、IL－17生成分泌等，控制Th17在炎癥反應(yīng)中的作用，有望成為控制高原低氧引起的肺臟等器官的炎癥反應(yīng)的新靶點(diǎn)，對(duì)于促進(jìn)高原習(xí)服、防治缺氧性肺動(dòng)脈高壓、防治高原心臟病有十分重要的意義。但Th17細(xì)胞進(jìn)入肺組織如何作用于其它炎癥細(xì)胞或局部組織細(xì)胞等詳細(xì)胞機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步深入研究。

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Relationship between Th17 cells infiltrated in lungs and pulmonary vascular reconstruction under hypobarric hypoxia

CUI Yu1，GUAN Li－bin1，LI Xiao－xu1，YANG Cheng－zhong1，TAN Xiao－ling1，GAO Yuqi2，HUANG Jian1

(1Department of High Altitude Physiology and High Altitude Biology，2Department of High Altitude Special Procurement Medicine and High Altitude Special Procurement Equipment，Key Laboratory of High Altitude Medicine of Education Ministry，Key Laboratory of High Altitude Physiology and High Altitude Disease of PLA，College of High Altitude Military Medicine，Third Military Medicine University，Chongqing 400038，China.E-mail:hj3red@gmail.com)

AIM:To investigate the changes of retinoid－related orphan receptor γt(RORγt)mRNA and interleukin－17(IL－17)protein in the lung tissue under hypobaric hypoxia，and the relationship between Th17 cells and hypoxic pulmonary vascular reconstruction.METHODS:Male BALB/c mice(n=50)were randomly divided into control group and 3 d，7 d，14 d and 28 d hypobaric hypoxia groups.The mice in hypobaric hypoxia groups were housed in a hypobaric hypoxia chamber(simulated altitude of 6 000 m)for 3 d，7 d，14 d or 28 d.The mice in control group were housed in normal pressure and oxygen environment.The hemodynamic data were recorded by cardiac catheterization.The hypertrophy of right ventricle was evaluated by the ratio of weight of the right ventricle to the weight of the left ventricle plus interventricular septum，and the right ventricular weight over body weight.The spleen was collected and the proportions of the Th17 (CD4+IL－17+RORγt+)cells were detected by flow cytometry.The serum levels of IL－4，IL－6 and IL－17 and the changeof IL－17 in the lung tissue were measured by ELISA.The mRNA expression of RORγt in the spleen and lung tissues was measured by RT－qPCR.RESULTS:Compared with control group，the mouse right ventricular systolic pressure，the hypertrophy index of right ventricle and the serum IL－17 level were significantly elevated in hypoxia groups，which was consistent with the results of flow cytometry.The mRNA expression of RORγt in the lung tissue was also significantly increased in 7 d，14 d and 28 d hypoxia groups.The expression of IL－17 in the lung tissue was significantly increased in 14 d and 28 d hypoxia groups.CONCLUSION:Hypoxia promotes differentiation of Th0 cells to Th17 cells in the spleen.The Th17 cells infiltrated in the lung tissue under hypobarric hypoxia are involved in pulmonary vascular reconstruction.

Th17 cells;Retinoid－related orphan receptor γt;Interleukin－17;Hypoxic pulmonary hypertension

R392.32

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.011

1000－4718(2015)02－250－06

2014－11－18

2014－12－24

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012CB518201);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81370150;No.30973446)

△通訊作者Tel:023－68772383;E－mail:hj3red@gmail.com