宋哲，薛超，張小曼，張葉敏，何小華，尹君

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071)

脂聯(lián)素通過激活PP2A減輕H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷及tau蛋白過度磷酸化*

宋哲，薛超，張小曼，張葉敏，何小華△，尹君△

(武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430071)

目的:觀察脂聯(lián)素(adiponectin)對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH－SY5Y細(xì)胞活力及tau蛋白磷酸化的影響并探討其作用機(jī)制。方法:采用MTT法并觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測脂聯(lián)素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH－SY5Y細(xì)胞活力損傷的影響;應(yīng)用Western blotting觀察脂聯(lián)素對(duì)tau蛋白磷酸化及蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)和糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β)活性的影響。結(jié)果:脂聯(lián)素減輕了H2O2誘導(dǎo)的SH－SY5Y細(xì)胞損傷(P＜0.01)。脂聯(lián)素上調(diào)了H2O2誘導(dǎo)的SH－SY5Y細(xì)胞的PP2A活性，明顯減輕此時(shí)tau的異常過度磷酸化(P＜0.01)。PP2A抑制劑岡田酸阻斷了脂聯(lián)素的保護(hù)作用(P＜0.01)。脂聯(lián)素同時(shí)使H2O2誘導(dǎo)的SH－SY5Y細(xì)胞的GSK－3β磷酸化水平上升(P＜0.01)。結(jié)論:脂聯(lián)素減輕H2O2誘導(dǎo)的SH－SY5Y細(xì)胞損傷及tau蛋白異常過度磷酸化，其機(jī)制可能與激活PP2A并抑制GSK－3β信號(hào)途徑有關(guān)。

脂聯(lián)素;過氧化氫;蛋白磷酸酶2A;糖原合酶激酶－3β;Tau蛋白

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶喪失和認(rèn)知障礙［1］。AD的主要病理學(xué)特征為患者腦內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrilary tangle，NFT)、大量老年斑(senile plaque，SP)和神經(jīng)元丟失等。NFT位于神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)，由異常過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau相互纏結(jié)形成。Tau異常過度磷酸化的機(jī)制并不完全清楚，相當(dāng)多證據(jù)表明可能與腦部蛋白激酶(protein kinases，PK)和蛋白磷酸酶(protein phosphatases，PPs)的活性改變有關(guān)［2］，其中較為重要的有糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase－3β，GSK－3β)和蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)。AD患者腦中GSK－3β活性增強(qiáng)［3］，以及PP2A活性抑制［4］可使tau蛋白的磷酸化水平顯著升高［5］，促進(jìn)AD的發(fā)生。

脂聯(lián)素(adiponectin，Adipo)是機(jī)體重要的細(xì)胞因子，主要由脂肪組織分泌，具有抗炎、抗氧化和調(diào)節(jié)胰島素敏感性等功能［6］。在外周組織中，脂聯(lián)素對(duì)高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝和2型糖尿病等有改善作用［6］。脂聯(lián)素是胰島素的增敏因子，能夠增加磷脂酰肌醇3－激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的活性［7］，Akt作為GSK－3β的上游激酶，使GSK－3β的Ser9位點(diǎn)磷酸化而活性下降。脂聯(lián)素也可以影響PP2A的活性，在乳腺癌細(xì)胞中，脂聯(lián)素通過AMP活化蛋白激酶(AMP－activated protein kinase，AMPK)途徑激活PP2A從而降低腫瘤的侵襲性［8］。脂聯(lián)素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有一定作用，它不僅調(diào)節(jié)下丘腦攝食中樞［9］，影響中心體溫和能量代謝［10］，還能夠減輕卡因酸誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性［11］。報(bào)道顯示，AD患者往往有內(nèi)分泌的改變，血漿中脂聯(lián)素含量異常［12］，但脂聯(lián)素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用尚不清楚。本文通過觀察脂聯(lián)素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷及tau蛋白過度磷酸化的影響，探討了脂聯(lián)素對(duì)AD的影響及其機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

脂聯(lián)素由美國德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心Lily Q.Dong教授惠贈(zèng)。PP2A、p－GSK－3β(Ser9)和p－tau (Ser396)抗體購于Cell Signaling;GSK－3β抗體購于Signalway Antibody LLC;p－tau(Ser404)抗體購于Santa Cruz;tau－5、p－PP2A(Tyr307)和β－actin抗體購于Abcam;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和BCA蛋白檢測試劑盒購于Pierce;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自Hyclone;MTT粉劑(Biosharp);H2O2溶液(國藥集團(tuán));二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購于上海申工，其它試劑購于Sigma。

Western blotting設(shè)備(Bio－Rad);SW－CJ系列超凈工作臺(tái)(江蘇安泰空氣技術(shù)有限公司);CO2培養(yǎng)箱(Forma);倒置顯微鏡(Nikon);多功能酶標(biāo)儀(BioTek)。

2 方法

2.1 SH－SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SHSY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)，置于37℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組為研究H2O2對(duì)細(xì)胞的損傷作用，給予細(xì)胞不同濃度H2O2處理1 h后檢測細(xì)胞活力，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)中H2O2的濃度。為了研究脂聯(lián)素的保護(hù)作用，細(xì)胞分為對(duì)照組、脂聯(lián)素組、H2O2組和H2O2+脂聯(lián)素組。在H2O2(200 μmol/L)處理40 min后，給予脂聯(lián)素(2 mg/L)與H2O2共同作用20 min，進(jìn)行MTT檢測、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及Western blotting檢測。岡田酸(okadaic acid，OA)抑制實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞分為H2O2處理組、脂聯(lián)素+H2O2組、OA+ H2O2組和脂聯(lián)素+OA+H2O2組。細(xì)胞給予1 nmol/L OA預(yù)處理1 h后，在加入H2O2和脂聯(lián)素共同作用。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞活力的檢測細(xì)胞活力采用MTT法進(jìn)行測定。細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，接種密度為5×103/L，每孔培養(yǎng)液體積為100 μL，每組設(shè)定6個(gè)平行孔。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度(0、100、200、400和600 μmol/L)的H2O2，37℃作用1 h。每孔加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，輕搖10 min，多功能酶標(biāo)儀490 nm波長下測定吸光度(absorbance，A)。

2.4 Western blotting檢測蛋白水平細(xì)胞處理結(jié)束后用預(yù)冷的1×PBS洗2次，6孔板每孔加入含磷酸酶抑制劑的RIPA buffer裂解細(xì)胞，12 000×g離心10 min，獲取上清。BCA法測定細(xì)胞蛋白濃度后，行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，1×TBST洗膜，I抗4℃孵育過夜。洗膜，加入HRP標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。洗膜后ECL顯色。膠片掃描并用ImageJ圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較并采用單因素方差分析(one－way ANOVA)及LSD－t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 不同濃度H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

H2O2誘導(dǎo)了SH－SY5Y細(xì)胞的急性損傷。不同濃度(0、100、200、400和600 μmol/L)的H2O2作用于SH－SY5Y細(xì)胞1 h，MTT法測定細(xì)胞活力，結(jié)果見圖1。在100 μmol/L H2O2處理時(shí)，細(xì)胞活力有所下降，但沒統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。給予更高濃度H2O2處理，細(xì)胞活力顯著下降且呈劑量依賴性，200、400和600 μmol/L組的細(xì)胞活力分別是對(duì)照組的83.9%、47.8%和31.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。因200 μmol/L是使細(xì)胞活力下降的最低濃度，所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用H2O2濃度均為200 μmol/L。

Figure 1.The viability of SH－SY5Y cells incubated with H2O2at different concentrations.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖1 不同濃度H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

2 脂聯(lián)素對(duì)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

給予SH－SY5Y細(xì)胞200 μmol/L H2O2處理40 min后，加入2 mg/L脂聯(lián)素與H2O2共同作用20 min，MTT法檢測細(xì)胞活力，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。與對(duì)照組相比，H2O2處理組的細(xì)胞活力顯著下降(P＜0.01)。給予脂聯(lián)素后，H2O2的損傷作用被抑制，細(xì)胞活力由損傷時(shí)的81.5%升高到95.8%(P＜0.01)，基本恢復(fù)正常。與對(duì)照組相比，單獨(dú)應(yīng)用脂聯(lián)素對(duì)細(xì)胞活力沒有明顯影響(P＞0.05)。在100倍顯微鏡下，各組細(xì)胞外形完好，突起正常，形狀無明顯差異，見圖2。上述結(jié)果說明脂聯(lián)素能減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。

3 脂聯(lián)素降低H2O2誘導(dǎo)的tau蛋白異常過度磷酸化

SH－SY5Y細(xì)胞在H2O2作用下給予脂聯(lián)素處理，檢測細(xì)胞內(nèi)tau蛋白的Ser396和Ser404位點(diǎn)磷酸化及總tau蛋白(tau－5)水平的變化，β－actin作為內(nèi)參照。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，H2O2處理組的tau蛋白在Ser396和Ser404位點(diǎn)的磷酸化水平顯著上升(P＜0.01)，給予脂聯(lián)素后，tau蛋白的磷酸化水平下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)?？倀au蛋白在組間無差異，單獨(dú)給予脂聯(lián)素對(duì)tau蛋白的磷酸化水平無明顯影響(P＞0.05)，見圖3。

4 脂聯(lián)素對(duì)PP2A活性的影響

與對(duì)照組相比，H2O2處理組PP2A的Tyr307位點(diǎn)磷酸化(非活性形式)水平明顯增高，導(dǎo)致PP2A活性下降(P＜0.01);給予脂聯(lián)素后，PP2A的Tyr307磷酸化水平明顯降低，活性升高(P＜0.01);單獨(dú)給予脂聯(lián)素時(shí)，PP2A的總量及磷酸化水平無明顯改變(P＞0.05)，見圖4。上述結(jié)果說明H2O2通過抑制PP2A活性使tau蛋白異常過度磷酸化，而脂聯(lián)素可以通過增加PP2A活性減輕H2O2誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化。

5 PP2A抑制劑OA對(duì)脂聯(lián)素保護(hù)作用的影響

SH－SY5Y細(xì)胞預(yù)先給予PP2A抑制劑OA(1 nmol/L)處理1 h，隨后加入H2O2和(或)脂聯(lián)素后提取蛋白，檢測tau蛋白的總量和磷酸化水平。結(jié)果顯示，與H2O2組相比較，脂聯(lián)素+H2O2組的p－tau Ser396顯著降低(P＜0.01)。如預(yù)先給予OA，脂聯(lián)素降低tau蛋白磷酸化的作用明顯減弱，p－tau Ser396上升(P＜0.01)，且與OA+H2O2組比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。上述結(jié)果說明脂聯(lián)素主要是通過激活PP2A來降低H2O2誘導(dǎo)的tau蛋白過度磷酸化。

Figure 3.The effects of adiponectin(Adipo)on H2O2－induced hyperphosphorylation of tau in the SH－SY5Y cells.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H2O2.圖3 脂聯(lián)素降低H2O2誘導(dǎo)的tau蛋白異常過度磷酸化

Figure 4.The effects of adiponectin(Adipo)on PP2A activity in the SH－SY5Y cells.Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs H2O2.圖4 脂聯(lián)素對(duì)PP2A活性的影響

Figure 5.The effects of PP2A inhibitor OA on the cytoprotective function of adiponectin(Adipo).Mean±SEM.n=3.＊＊P＜0.01 vs H2O2;##P＜0.01 vs Adipo+ H2O2.圖5 PP2A抑制劑OA對(duì)脂聯(lián)素保護(hù)作用的影響

6 脂聯(lián)素對(duì)GSK-3β磷酸化的影響

H2O2組GSK－3β的Ser9位點(diǎn)磷酸化(非活性形式)水平增高，為對(duì)照組的119.6%(P＜0.05);繼續(xù)給予脂聯(lián)素后p－GSK－3β Ser9增加至對(duì)照組的175.2%(P＜0.01);單獨(dú)給予脂聯(lián)素組GSK－3β的磷酸化水平無明顯改變(P＞0.05)，GSK－3β的總量在組間無顯著差異，見圖6。

Figure 6.The effects of adiponectin(Adipo)on the phosphorylation level of GSK－3β in the SH－SY5Y cells.Mean± SEM.n=3.*P＜0.05 vs control;##P＜0.01 vs H2O2.圖6 脂聯(lián)素對(duì)GSK-3β磷酸化的影響

討論

AD是老年人最常見的癡呆類型，發(fā)病機(jī)制不甚明確。目前認(rèn)為AD由多因素引起，并提出了多種假說，包括異常蛋白聚積學(xué)說，Aβ級(jí)聯(lián)反應(yīng)學(xué)說，氧化應(yīng)激學(xué)說及細(xì)胞凋亡學(xué)說等。越來越多的資料證明，氧化應(yīng)激作為可能的觸發(fā)因素，與其它機(jī)制相互作用。在AD早期，患者出現(xiàn)臨床癥狀之前就存在氧化損傷［13］。氧化應(yīng)激還參與了AD特征性病理學(xué)改變NFT的形成及神經(jīng)元凋亡［14］。本實(shí)驗(yàn)采用H2O2處理細(xì)胞，模擬機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)活力降低及tau異常過度磷酸化的表現(xiàn)，這與其它文獻(xiàn)在人胚腎HEK293/tau細(xì)胞上的研究結(jié)果類似［15］。

脂聯(lián)素作為外周重要的脂肪因子，對(duì)體內(nèi)多條信號(hào)途徑有調(diào)節(jié)作用。脂聯(lián)素能夠增加人乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞中PP2A的活性，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移［8］。我們研究發(fā)現(xiàn)，SH－SY5Y細(xì)胞在H2O2存在的條件下，脂聯(lián)素能明顯激活PP2A;在沒有H2O2的條件下，脂聯(lián)素對(duì)PP2A活性的影響則不明顯。上述表現(xiàn)和乳腺癌細(xì)胞中即使無外界刺激脂聯(lián)素仍能激活PP2A的表現(xiàn)不甚一致［8］，可能是外周組織細(xì)胞與中樞神經(jīng)細(xì)胞對(duì)脂聯(lián)素反應(yīng)性不同所造成。PP2A的激活使tau去磷酸化，我們的研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予OA阻斷PP2A時(shí)，脂聯(lián)素降低tau磷酸化水平的作用消失，說明脂聯(lián)素在很大程度上通過PP2A途徑起作用。

Tau蛋白的磷酸化水平也受蛋白激酶調(diào)控［16］。其它小組研究發(fā)現(xiàn)，在H2O2作用下，HEK293/tau細(xì)胞的p－GSK－3β(Ser9)(非活性形式)水平增高，其作者認(rèn)為此時(shí)GSK－3β存在被切割的情況，GSK－3β活性仍然上升［15］。另一研究也發(fā)現(xiàn)大鼠原代皮層神經(jīng)元在H2O2作用下p－GSK－3β(Ser9)水平增高，作者認(rèn)為是代償反應(yīng)［17］。我們研究發(fā)現(xiàn)，盡管在H2O2作用下SH－SY5Y細(xì)胞的p－GSK－3β(Ser9)水平增高，然而此時(shí)tau蛋白呈現(xiàn)出過度磷酸化狀態(tài)，可以推測此時(shí)tau蛋白的過度磷酸化主要由PP2A活性下降引起，而GSK－3β活性是否變化需要進(jìn)一步研究。脂聯(lián)素在H2O2刺激條件下使p－GSK－3β(Ser9)明顯上升，可能是脂聯(lián)素激活了PI3K/Akt途徑，這在大鼠心肌細(xì)胞上有類似表現(xiàn)［18］。與我們發(fā)現(xiàn)的PP2A結(jié)果類似，無H2O2存在時(shí)脂聯(lián)素對(duì)GSK－3β活性影響不大，說明脂聯(lián)素的保護(hù)作用主要體現(xiàn)在機(jī)體受損的狀態(tài)下，這為AD的防治提供了新思路。

細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)不斷生成和清除，當(dāng)氧化作用超過了抗氧化作用時(shí)，氧化應(yīng)激就會(huì)發(fā)生。脂聯(lián)素在外周組織中具有抗氧化特性，如在人腎小球系膜細(xì)胞中給予脂聯(lián)素能降低ROS保護(hù)機(jī)體［19］。在我們的研究中，脂聯(lián)素同樣可能是通過降低ROS來增加細(xì)胞活力并減輕tau的過度磷酸化。

總之，本研究證實(shí)脂聯(lián)素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷及tau蛋白過度磷酸化具有抑制作用，其機(jī)制可能與激活PP2A和抑制GSK－3β信號(hào)途徑有關(guān)。本研究為脂聯(lián)素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是神經(jīng)退行性疾病的臨床應(yīng)用提供了新的依據(jù)。

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Adiponectin attenuates H2O2-induced SH-SY5Y cell injury and tau hyperphosphorylation via activating PP2A

SONG Zhe，XUE Chao，ZHANG Xiao－man，ZHANG Ye－min，HE Xiao－h(huán)ua，YIN Jun

(School of Basic Medical Sciences，Wuhan University，Wuhan 430071，China.E-mail:hexiaohua@whu.edu.cn;yinjun@ whu.edu.cn)

AIM:To study the effects of adiponectin on H2O2－induced cell injury and tau hyperphosphorylation in human neuroblastoma SH－SY5Y cells.METHODS:Cell viability was determined by MTT assay.H2O2－induced cell injury and morphological changes in the SH－SY5Y cells with or without adiponectin treatment were observed.The level of tau phosphorylation as well as the activities of protein phosphatase 2A(PP2A)and of glycogen synthase kinase－3β(GSK－3β) were examined by Western blotting.RESULTS:Adiponectin significantly attenuated H2O2－induced cell injury (P＜0.01).Adiponectin upregulated the activity of PP2A and decreased phosphorylation levels of tau under the stimulation with H2O2(P＜0.01).Okadaic acid，a specific inhibitor of PP2A，blocked the protective effects of adiponectin(P＜0.01).Adiponectin increased the phosphorylation level of GSK－3β at Ser9 site under H2O2stimulation(P＜0.01).CONCLUSION:Adiponectin protects SH－SY5Y cells against H2O2－induced cell injury and decreases tau hyperphosphorylation by activating PP2A and inactivating GSK－3β.

Adiponectin;Hydrogen peroxide;Protein phosphatase 2A;Glycogen synthase kinase－3β;Tau proteins

R363

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.003

1000－4718(2015)02－207－06

2014－10－31

2015－01－08

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81100594);教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(No.20100141120057)

△通訊作者何小華Tel:027－68759991;E－mail:hexiaohua@whu.edu.cn;尹君Tel:027－68759846;E－mail:yinjun@whu.edu.cn