涂飛云，劉曉華，杜聯(lián)明，嚴超超，黃曉鳳*

(1.江西省林業(yè)科學院，江西 南昌 330013;2.四川大學 生命科學學院/四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室，四川 成都 610064)

微衛(wèi)星又稱簡單序列重復(simple sequence repeats，SSRs)，是指1～6 bp的核苷酸為基本重復單位的串聯(lián)重復序列，其長度大多在100 bp以內［1］，廣泛存在于真核生物和一些原核生物的基因組中［2］。微衛(wèi)星因突變速率快、多態(tài)性高等特性，廣泛應用于動物個體識別［3-5］、群體遺傳研究［6-7］、基因定位［8］、系統(tǒng)發(fā)育［9］及遺傳疾病研究［10］。

隨著基因測序技術發(fā)展，更多物種的全基因組被測定和公布，有關動物基因組微衛(wèi)星報道也越來越多。到目前為止，有關哺乳動物全基因的序列公布有43種(http://asia.ensembl.org/info/data/ftp/index.html)，但哺乳動物全基因微衛(wèi)星分布規(guī)律研究報道文獻僅見4篇［11-14］。大鼠是繼人類、小鼠之后第三個被測定全基因組的哺乳動物，是極好的模式生物，作為實驗材料廣泛地應用于醫(yī)學、藥學研究中。Tóth等［15］利用嚙齒類81個物種的基因序列(其中大鼠基因序列貢獻率是18.25%)進行微衛(wèi)星序列分析。迄今為止，大鼠全基因組微衛(wèi)星分布狀況未見報道。本研究通過生物信息學方法搜索大鼠全基因組微衛(wèi)星，并對微衛(wèi)星數(shù)量、分布、頻率進行分析，為進一步開發(fā)大鼠微衛(wèi)星的標記提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 大鼠基因組序列

大鼠全基因組序列是從NCBI數(shù)據(jù)庫下載的版本名為Rnor_6.0(2014年8月發(fā)布)的基因組序列(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/Rattus_norvegicus)。該基因組包括 20 個常染色體、2 個性染色體(X，Y)和未定位到染色體上的序列(其中已經定位到染色體上的序列占全基因組的99%)，基因組總長度約2.8 Gb，所有序列都以FASTA格式保存。

1.2 數(shù)據(jù)處理

1.2.1 微衛(wèi)星序列統(tǒng)計術語的定義 微衛(wèi)星序列統(tǒng)計術語的定義參照戚文華等［12-13］的研究。

1.2.2 微衛(wèi)星搜索及統(tǒng)計分析 MSDB是用Perl語言編開發(fā)的界面友好的分析軟件，能快速識別和搜索全基因組微衛(wèi)星。與其他微衛(wèi)星搜索軟件如TRF、SSRTT、MSATCOMMANDER等軟件相比，MSDB具有運算速度快，操作簡便，易于分析等特點［16］。本研究利用微衛(wèi)星搜索軟件MSDBv2.4.3［16］對不同染色體基因序列進行微衛(wèi)星搜索及統(tǒng)計。本研究的搜索標準采用軟件默認設置，模式設置為Perfect Search，最小重復(Minimum repeats)設置為單堿基12次重復以上、二堿基7次重復以上、三堿基5次以上、四堿基、五堿基和六堿基4次以上［16］。利用SPSS軟件對大鼠染色體序列長度與微衛(wèi)星數(shù)量分析。參照堿基互補配對原則和統(tǒng)計拷貝數(shù)起始堿基順序的排列差異，利用Perl語言腳本將同類重復兼并為一種重復拷貝類型代表，如三堿基AAC，可以與之兼并的有ACA、CAA、TTG、TGT和GTT。

2 結果與分析

2.1 大鼠微衛(wèi)星在全基因組及染色體分布特征

大鼠基因組全長2 860 318 831 bp，微衛(wèi)星總數(shù)1 483 525個，其總長度是40 198 048 bp，占全基因組的1.41%(表1)。大鼠各染色體中，1號染色體的微衛(wèi)星數(shù)量最多，有144 384個，占微衛(wèi)星總數(shù)的9.7%，出現(xiàn)的頻率是511個/Mb，其長度合計3 941 664 bp，其次是2號、4號、3號染色體，分別占微衛(wèi)星總數(shù)的8.5%、6.3%、6.2%(表1)，20號染色體分布的微衛(wèi)星數(shù)量最低，僅占總數(shù)的2.3%。從各染色體微衛(wèi)星分布頻率看，12號染色體最高，其次是10號，最低X性染色體。通過線性回歸分析表明，大鼠染色體DNA序列越長，所含微衛(wèi)星數(shù)量越多(r=0.978，P＜0.000 1)。大鼠性染色體微衛(wèi)星數(shù)量存在顯著差異，X染色體微衛(wèi)星數(shù)量有62 578，占總數(shù)的4.2%，而Y染色體微衛(wèi)星數(shù)量僅有35 067，僅占2.4%(表1)。

2.2 不同重復類型微衛(wèi)星分布特點

從表1看，整個大鼠全基因組中不同重復類型微衛(wèi)星占全基因組微衛(wèi)星比例表現(xiàn)為二堿基(46.9%)＞單堿基(22.6%)＞四堿基(17.4%)＞三堿基(8.4%)＞五堿基(2.4%)＞六堿基(2.0%)。

不同重復類型微衛(wèi)星在染色體分布數(shù)量上，6種重復類型(單堿基、二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、六堿基)微衛(wèi)星總數(shù)在1號染色體分布最多，其次是2號染色體。不同重復類型微衛(wèi)星分布數(shù)量最少的染色體并不一致(表1)。

從不同重復類型微衛(wèi)星重復拷貝類別數(shù)量比例看，單堿基以A微衛(wèi)星數(shù)量占優(yōu)勢，分別占單堿基微衛(wèi)星總數(shù)的46.6%。二堿基微衛(wèi)星類型搜索到4種，有AC、AG、AT、CG，整個大鼠全基因組序列以AC類型最多，占二堿基微衛(wèi)星總數(shù)的64.6%，其次是AG，占24.9%，CG最少，僅占0.6%。共兼并及統(tǒng)計三堿基微衛(wèi)星重復類型 10 種，包括 AAC、AAG、AAT、ACC、ACG、ACT、AGC、AGG、AGT、CCG，其中AGG類型數(shù)量最多，占三堿基微衛(wèi)星總數(shù)的 21.2%，依次是 AAC、AAT，占20.8%、13.5%;CCG 類型最少，其次是AGC，分別占0.9%和3.4%。四堿基微衛(wèi)星類型以AAAC類型最多，占四堿基微衛(wèi)星總數(shù)的14.9%，其次是AGAT和AAAG，占11.9%和11.1%。五堿基微衛(wèi)星以AAACA占優(yōu)勢，占39.8%。六堿基以ACAGAG占優(yōu)勢，占18.9%。

表1 大鼠不同染色體上不同類型微衛(wèi)星數(shù)量的分布情況Tab.1 Distribution of SSRs in each chromosome of rat

3 討論

本研究首次利用生物信息學方法搜索、統(tǒng)計、分析大鼠全基因組微衛(wèi)星數(shù)量、分布及頻率。大鼠全基因組共搜索到微衛(wèi)星總數(shù)1 483 525，其序列長度占全基因組的1.41%。本研究表明微衛(wèi)星數(shù)量與其所在染色體DNA序列長度具有相關性(r=0.978，P＜0.000 1)，反映了SSRs在染色體上的分布具有隨機性，與先前其他研究結果一致［13、17］，進一步支持Hancock［18］提出的微衛(wèi)星數(shù)量與染色體大小相關的假說。

不同物種基因組優(yōu)勢類型微衛(wèi)星有所不同。秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans［18］、肩突硬蜱Ixodes scapularis［19］、紅原雞 Gallus gallus［17］、四川山鷓鴣 Arborophila rufipectus［20］、牛 Bos taurus［12］、綿羊Ovis aries［12］、豬 Sus scrofa［13］等全基因組均以單堿基占優(yōu)勢;二斑葉螨 Tetranychus urticae［19］全基因組以三堿基占優(yōu)勢;蚊子Anopheles gambiae［21］以六堿基占優(yōu)勢。本研究大鼠基因組微衛(wèi)星以二堿基微衛(wèi)星占絕對優(yōu)勢，與果蠅 Drosophila melanogaster［22］、家蠶 Bombyx mori［23］、蜜蜂 Apis mellifera［24］、河豚 Fugu rubripes［25］、全基因組及中國對蝦 Fenneropenaeus chinensis［26］、嚙齒類［19］部分基因組中二堿基微衛(wèi)星占主導結果一致。

本研究中大鼠全基因組單堿基微衛(wèi)星以A占優(yōu)勢，與人類、紅原雞、豬等物種研究結果一致［15］，其余不同重復類型微衛(wèi)星在不同類群中具有差異。大鼠二堿基微衛(wèi)星以AC最為豐富，與人類、果蠅、蚊子、豬、牛和綿羊的結果一致，不同于中國對蝦、蜜蜂、紅原雞二堿基以AT最豐富。三堿基、四堿基、五堿基、六堿基分別以 AGG、AAAC、AAACA、ACAGAG占優(yōu)勢，而其他物種如豬、牛、羊并非以此四種(AGG、AAAC、AAACA、ACAGAG)類型微衛(wèi)星占優(yōu)勢，可能是不同物種優(yōu)勢類型微衛(wèi)星有所不同。

致謝:特別感謝四川大學生命科學學院李午佼博士對研究的幫助。

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