齊瑞芳，于小玲，趙 輝

(1.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060; 2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東青島 266021)

姜黃素對前列腺癌PC3細胞遷移的抑制作用及對MMP2體內(nèi)外表達影響?

齊瑞芳1，2，于小玲2△，趙 輝2

(1.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060; 2.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東青島 266021)

目的:觀察不同濃度姜黃素對前列腺癌PC3細胞侵襲浸潤的抑制作用以及對金屬基質(zhì)蛋白酶2(MMP2)表達的影響。方法:采用細胞劃痕實驗觀察姜黃素對PC3細胞遷移能力的影響;建立PC3裸鼠移植瘤，western blotting檢測PC3細胞和移植瘤組織中MMP2蛋白的表達，實時熒光定量PCR檢測MMP2 mRNA的表達。結(jié)果:姜黃素可減弱PC3細胞的遷移浸潤能力，并下調(diào)MMP2的表達且呈劑量依賴性。結(jié)論:姜黃素可有效地抑制PC3細胞的遷移能力，下調(diào)MMP2的表達。

姜黃素;前列腺癌;侵襲;MMP2

中藥姜黃具有破血行氣、通經(jīng)止痛之功效，其主要有效成分為姜黃素(curcumin)［1］。姜黃素曾作為食物上色和佐餐劑廣泛用于食品工業(yè)［2］。近些年，姜黃素的藥理作用不斷被研究發(fā)現(xiàn)，如抗炎、抗氧化、抗動脈硬化等，尤其是抗癌抗腫瘤作用被人們逐步認識并受到廣泛重視。本研究通過采用不同濃度的姜黃素作用于體外前列腺癌PC3細胞和體內(nèi)PC3細胞裸鼠移植瘤，觀察姜黃素對PC3細胞遷移浸潤能力的影響，并檢測與PC3侵襲浸潤能力有關(guān)系的金屬基質(zhì)蛋白酶2(matrix metalloproteinases MMP2)的表達。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人雄激素非依賴性前列腺癌細胞株—PC3細胞購自中國科學(xué)院細胞庫;胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司;胰蛋白酶、DMSO、BSA購自美國Solarbio公司;熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒; Trizol購自大連Takara公司;PMSF、細胞蛋白裂解液購自碧云天生物科技有限公司;MMP2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，姜黃素購自Sigma公司(DMSO稀釋成50mmol/L母液保存于-20℃，用時室溫融化);實時熒光定量PCR儀購自基因公司; Olympus IX70-142倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 前列腺癌PC3細胞的培養(yǎng) 人前列腺癌細胞PC3培養(yǎng)于含10%(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃、5%(體積分數(shù))CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2 裸鼠移植瘤的建立 BALB雄性SPF級裸鼠24只，鼠齡4周，體質(zhì)量15～18 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。在恒溫(25～27℃)、恒濕(40% ～60%)、無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)條件下飼養(yǎng)。實驗前動物飼養(yǎng)2周適應(yīng)環(huán)境。PC3細胞傳代培養(yǎng)3～4代，取對數(shù)生長期細胞胰酶消化，無血清的培養(yǎng)液或PBS洗滌。離心收集細胞，按照10×107/ml用PBS制成細胞懸液，每只抽取0.2 ml細胞懸液注射于右側(cè)腋窩處皮下，每天觀察記錄腫瘤形成情況。當腫瘤直徑達3 mm3時，將裸鼠按隨機數(shù)字表法分為4組各6只，腹腔注射藥物0.2 ml/次共30 d。①空白對照組生理鹽水隔日1次;②姜黃素組將姜黃素分為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3組，隔日1次。

1.2.3 細胞侵襲劃痕實驗 在24孔板中加入5×105個細胞常規(guī)培養(yǎng)，待細胞長滿融合，用細胞刮劃一約2 mm的線，PBS沖洗刮掉的細胞，然后加入不同濃度的姜黃素，無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察細胞向無細胞劃痕區(qū)域遷移的情況。每組設(shè)4個復(fù)孔，試驗重復(fù)3遍。每孔中隨機拍6個視野的劃痕照片，細胞遷移的平均距離用JD801形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)來測量計算。

1.2.4 Western blotting檢測MMP2蛋白表達

按說明書加入PMSF和細胞裂解液常規(guī)提取PC3細胞及移植瘤組織中的蛋白，BCA法蛋白定量，每孔加入等量的蛋白進行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上，用5% BSA封閉1 h，加一抗稀釋液(1∶100稀釋)4℃過夜，TTBS洗膜，結(jié)合辣根過氧化物酶標記二抗(1∶200稀釋)，TTBS洗膜，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑在X光膠片上曝光、顯影、定影。以actin為內(nèi)參，應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)進行條帶掃描分析，結(jié)果以蛋白條帶的面積積分值與actin的面積積分值比值表示。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測MMP2 mRNA的相對表達量 用Trizol提取細胞及移植瘤組織中的總RNA，用分光光度計測定其OD值，檢測其純度。如OD260/OD280在1.8～2.0之間，表明無蛋白質(zhì)污染。逆轉(zhuǎn)錄以DNA為模板進行PCR擴增。實時熒光PCR引物由大連寶生物公司設(shè)計合成，MMP2上游引物序列:5'-GATAACCTGGATGCCGT CGTG-3';下游引物序列:5'-CAGCCTAGCCAGTCGG ATTTG-3'。以GAPDH為內(nèi)參，上游引物序列:5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3';下游引物序列為: 5'-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3'。Real time PCR反應(yīng)條件:94℃ 3 min，90℃ 30 s，60℃ 45 s，共40個循環(huán)。所有實驗管均采用雙管取其平均值，所有PCR產(chǎn)物再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實為特異性條帶。用Real time PCR得到MMP2 mRNA的CT值分別與其相對應(yīng)GAPDH的CT值相減進行校正得到校正CT值(即ΔCT)。以前列腺癌細胞空白對照檢測到的GAPDH mRNA熒光均值作為參數(shù)，目的基因相對表達 量 的 拷 貝 數(shù) 計 算 公 式［3］: 2-ΔΔCT= 2-(ΔCT目的基因-ΔCT對照基因)。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對PC3細胞劃痕侵襲實驗

表1圖1顯示，未加藥物對照組24 h后與加藥前比較，細胞呈梭型生長并向劃痕區(qū)伸出偽足，細胞間距明顯縮小;姜黃素組在5～30 μmol/L范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，細胞向劃痕區(qū)遷移生長的能力明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 姜黃素對PC3細胞遷移距離的影響

圖1 劃痕實驗檢測姜黃素對PC3細胞遷移能力的影響

2.2 姜黃素對MMP2蛋白表達的影響

為進一步研究姜黃素對PC3細胞侵襲浸潤能力的影響，用 Western-Blot的方法檢測與PC3細胞侵襲浸潤能力有關(guān)的MMP2蛋白表達情況。實驗結(jié)果顯示，5～30μmol/L的濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增加，PC3細胞中MMP2蛋白表達呈逐漸下降趨勢(見圖2);同樣裸鼠移植瘤中MMP2蛋白的表達隨姜黃素濃度增加而逐漸減弱(見圖3)，說明姜黃素可下調(diào)MMP2蛋白表達。

2.3 實時熒光定量PCR檢測MMP2 mRNA的表達

表2、3顯示，用Realtime PCR檢測PC3細胞和PC3細胞裸鼠移植瘤組織中MMP2 mRNA相對表達量的變化，結(jié)果表明姜黃素可降低MMP2 mRNA的表達，并呈現(xiàn)劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 姜黃素對PC3細胞MMP2 mRNA相對表達量的影響

表3 姜黃素對PC3細胞移植瘤組織MMP2 mRNA相對表達量的影響

圖2 姜黃素對PC3細胞MMP2蛋白表達的影響

3 討論

前列腺癌在美國位于男性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位、死亡率第二位［4］。在中國雖然發(fā)病率比較低，但死亡率較高，且隨著我國老齡化社會的進入，前列腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為影響老年男性健康的一大疾患。其發(fā)病隱匿，發(fā)現(xiàn)時多已發(fā)生轉(zhuǎn)移，成為雄激素非依賴性前列腺癌(AIPC)，甚至是難治性的前列腺癌(HRPC)。目前臨床上雖有外科手術(shù)療法、激素療法、化學(xué)藥物療法等多種治療方法，但沒有一種方法能明顯提高前列腺癌患者的存活率，所以尋找有效的綜合治療方法顯得更加迫切。目前采用中醫(yī)藥治療晚期前列腺癌已得到許多中西醫(yī)同行的認同，并成為新的研究熱點。

本研究通過體外培養(yǎng)前列腺癌PC3細胞并建立PC3細胞裸鼠移植瘤，采用細胞劃痕實驗觀察不同濃度姜黃素對PC3細胞遷移浸潤能力的影響，然后通過western blotting方法檢測與侵襲浸潤能力有關(guān)的MMP2蛋白的表達，用實時熒光定量PCR檢測MMP2 mRNA表達，發(fā)現(xiàn)姜黃素可以抑制PC3細胞的侵襲浸潤能力，下調(diào)MMP2蛋白及mRNA的表達，這將對臨床開發(fā)綜合治療方法提供重要的理論依據(jù)。

近年來，姜黃素作為被研究的熱點抗腫瘤藥物，其抗腫瘤作用機制比較復(fù)雜，目前普遍認為可能主要與抑制腫瘤細胞增殖［5］、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［6］、抑制腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移［7］等有關(guān)。本課題組研究表明，姜黃素可抑制前列腺癌PC3細胞生長并促進其凋亡［8］。此外，姜黃素作為抗癌藥除具有常用抗腫瘤藥物的作用外，還有其自身的特點，如保護胃腸道、心血管系統(tǒng)、肝臟和腎臟功能等功能［9］，減輕化療藥物的毒副作用。如將其用于臨床，對于延長患者生命、提高生活質(zhì)量會起到非常關(guān)鍵的作用。目前對姜黃素的藥效研究還處于實驗階段，主要原因是姜黃素在腸道不易吸收，口服后的系統(tǒng)生物利用度相對較低。但是姜黃素具有抗癌譜廣、毒副作用小等優(yōu)點，仍被腫瘤學(xué)家們認為是一種潛在的第三代抗腫瘤藥。

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Inhibition of Curcumin on Prostate Cancer PC3 Cell Invasion and Its Effect on the Expression of MMP2 in Vivo and in Vitro

QI Rui-fang1，2，YU Xiao-ling1△，ZHAO Hui2
(1．Preclinical and Forensic Medicine of Baotao Medical College，Inner Mongolia Baotao 014060，China; 2．Department of Pathophysiology，Medical College of Qingdao University，Shandong Qingdao 266021，China)

Objective:To observe the inhibitory effect of different concentrations of curcumin on prostate cancer PC3 cells and the effect on matrix metalloproteinase 2(MMP2)expression.Methods:Using Scratch test to observe the capacity of migration in PC3 cells;Prostate cancer cells PC3 xenografted tumors in nude mice were used.western blotting was applied to examine the protein of MMP2 in cell and xenografted tissues，real-time quantitative PCR was used to detect MMP2 mRNA.Results:Curcumin reduced the migratory ability of PC3 cells and downregulate the expression of MMP2，showing a dose-dependent manner.Conclusion:Curcumin can effectively inhibit the migratory ability of PC3 cell，reduced expression of MMP2.

Curcumin;Prostate cancer;Invasion;MMP2

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1398-03

2015-05-09

包頭醫(yī)學(xué)院秦文斌基金(201107)

齊瑞芳(1982-)，女，內(nèi)蒙古包頭人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，從事腫瘤的基因診斷及防治研究。

△通訊作者:于小玲(1964-)，女，山東人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，碩士研究生導(dǎo)師，從事腫瘤的基因診斷、防治及藥理藥代研究。