胡 翔 王 靜 陸 華

(1成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都，610075;2成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，成都，610041)

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為女性絕經(jīng)前后諸癥主要以腎陰虛證為主［1］，臨床實(shí)踐證明中醫(yī)補(bǔ)腎填精法對潮熱心悸［2］、陰道干澀、煩躁易怒、記憶力下降等低雌激素癥狀體征有明顯改善［3-4］。左歸丸出自明代醫(yī)家張景岳的《景岳全書·新方八陣》，為補(bǔ)益腎陰經(jīng)典方，臨床上可用于治療女性絕經(jīng)前后諸癥［5-6］。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn):絕經(jīng)后女性卵巢功能衰退，體內(nèi)主要通過性腺外組織(脂肪組織間充質(zhì)細(xì)胞［7］等)以腎上腺皮質(zhì)產(chǎn)生的雄烯二酮為底物通過芳香化酶(Romatase Cytochrome P450，P450arom)的催化作用生成雌酮，再轉(zhuǎn)化為活性強(qiáng)的雌二醇(Estradiol，E2)發(fā)揮作用。脂肪是女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素合成的主要部位之一［8］，健康絕經(jīng)后女性的內(nèi)臟脂肪在制造和轉(zhuǎn)化雌酮上比外周脂肪更為重要［9］。3T3-L1前脂肪細(xì)胞是Green和Kehinde于1974年從Swiss3T3小鼠胚胎中分離克隆所得，是目前國際上公認(rèn)的研究成脂過程的細(xì)胞株，能較好地模擬活體脂肪組織的功能［10-11］，可作為研究脂肪組織芳香化酶表達(dá)的體外實(shí)驗(yàn)載體［12］。本研究以3T3-L1前脂肪細(xì)胞為平臺，觀察含左歸丸去勢大鼠血清對體外培養(yǎng)的3T3-L1前脂肪細(xì)胞芳香化酶mRNA表達(dá)的影響，探索左歸丸改善絕經(jīng)后低雌激素水平癥狀的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及環(huán)境 育齡期雌性♀SD大鼠，(230±30)g，77只;購于成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)于二級動物實(shí)驗(yàn)室，合格證:SCXK(川)2004-11。室溫22～25℃，濕度45% ～65%，晝夜明暗交替時(shí)間為12∶12 h。

1.2 主要藥物和試劑 左歸丸(上海雷允上封濱制藥有限公司)，成人劑量18 g/d，批號:040810;倍美力(惠氏艾爾斯特制藥公司艾爾斯特藥廠生產(chǎn))，規(guī)格:0.625 mg/片，批號:PKG0404001;戊巴比妥鈉(上?；瘜W(xué)試劑公司進(jìn)口分裝)，批號:F20020405;雌二醇試劑盒(Alpha Diagnostic International公司)，批號:05114-B;3-異丁基 -1-甲基黃嘌呤(Isobuthyl-methylxan-thine，IBMX)、地塞米松(Dexamethasone，Dex)、胰島素(Insulin，Ins)均購于 Sigma公司;RT-PCR試劑盒:Takara，Lot:BK3101;Mouse Aromatase Primer:上海申能博彩生物科技有限公司。

1.3 主要儀器 CK40倒置顯微鏡(日本OLYMPUS);BB5060 CO2培養(yǎng)箱(德國HERAEUS);MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo);Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)、DU640紫外分光光度計(jì)(BECKMAN);HBPX220PCR儀(Hybaid);凝膠成像系統(tǒng)及圖象分析軟件(Kodak EDAS 290及Kodak 1D3.5)等。

1.4 動物造模及分組 除正常組(20只)外，所有大鼠均腹腔注射麻醉劑戊巴比妥鈉(30 mg/kg，1 mL/100 g)，麻醉成功后腹位固定，消毒手術(shù)區(qū)域。假手術(shù)組(17只)大鼠去除卵巢周圍部分脂肪組織(體積如卵巢大小)，其余40只大鼠行去卵巢手術(shù)。術(shù)后注射抗生素預(yù)防感染，觀察去卵巢大鼠陰道涂片5 d，去勢成功大鼠陰道涂片無動情周期表現(xiàn)。將去勢成功的大鼠隨機(jī)分為模型組(8只)、陽性對照組(11只)、左歸丸高劑量組(左高組，6只)、左歸丸低劑量組(左低組，9只)，正常組、假手術(shù)組、模型組每天灌服生理鹽水，左高組、左低組分別灌服左歸丸混懸液(0.6 g/100 g，0.15 g/100 g)，陽性對照組灌服倍美力水溶液(62.5μg/100 g)［13］，每組動物灌胃體積均為1 mL/100 g，3 d稱取一次體重，調(diào)整給藥劑量。連續(xù)灌胃11周，每天陰道涂片觀察陰道上皮細(xì)胞角化率。末次灌藥1 h后股動脈放血處死，所得血液靜置2 h后，離心3 000 r/min，15 min，取上層血清以酶聯(lián)免疫法測定E2值;剩余血清分組混勻，以0.22μm的微孔濾膜過濾除菌，保存于-70℃冰箱;將大鼠解剖后取得完整子宮稱取濕重。以大鼠子宮重量和血清E2值將正常組、假手術(shù)組大鼠分為正常組動情期、正常組動情間期、假手術(shù)組動情期、假手術(shù)組動情間期。

1.5 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞由地奧集團(tuán)d然藥物篩選中心提供。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后以含10%新生小牛血清(New Bron Calf Serum，NCS)、青霉素100 μ/L、鏈霉素100 μ/L的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于CO2培養(yǎng)箱中，48 h更換一次培養(yǎng)液。待細(xì)胞增殖至對數(shù)增長期后，將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，數(shù)量約5×104個(gè)/孔，培養(yǎng)1 d后，參照文獻(xiàn)方法［14］進(jìn)行誘導(dǎo)分化。

1.6 各類鼠血清培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞 小鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化48 h后，更換培養(yǎng)液:高糖DMEM培養(yǎng)液中含胰島素10 mg/L、丙酸睪酮10μL/mL和2%各類鼠血清。以無鼠血清組(含2%NCS、胰島素和丙酸睪酮)、無丙酸睪酮組(含2%NCS和胰島素)為對照。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化;取細(xì)胞培養(yǎng)液200μL，3 000 r/min，離心5 min后，取上清液測定E2值。

1.7 各類鼠血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞芳香化酶表達(dá)的影響 總RNA提取方法參照文獻(xiàn)［15］進(jìn)行，1%瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA質(zhì)量。參照文獻(xiàn)［16］設(shè)計(jì)小鼠芳香化酶上游引物5＇CCTTCCAGCCTTGTCAGGAAACA 3＇，下游引物:5＇CTCCTTGAGGGAAACTCATGCTCC 3＇(435bp)。以小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)對照(321 bp)。以總RNA 2μg，按cDNA試劑盒說明書操作，逆轉(zhuǎn)錄體系為20μL，合成cDNA保存于-20℃待用。按照RT-PCR試劑盒說明書，以Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20 μL。具體反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)［17］，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并照相。采用KODAK 1D圖像分析軟件分別檢測樣品P450arom目的帶和GAPDH內(nèi)對照帶的光密度值，并以P450arom/GAPDH比值半定量分析P450arom mRNA表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(ˉx±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。高組前脂肪細(xì)胞P450arom mRNA表達(dá)低于模型組(總RNA均為2μg)，高于陽性對照組(總RNA 4μg時(shí)仍未能成功擴(kuò)增)。

表1 灌服左歸丸高低劑量11周對去勢雌鼠體重差的影響(ˉx±s)

表2 灌服左歸丸高低劑量11周對去勢雌鼠血清E2值的影響(ˉx±s)

表3 2%各類鼠血清培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞48h后細(xì)胞上清E2值(pg/mL，ˉx±s)

2 結(jié)果

給予左歸丸11周后，左高組、左低組與模型組比較，給藥前后體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。給予左歸丸11周后，左高組、左低組與模型組比較，血清E2值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2%各類鼠血清培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞48h后，左高組、左低組與模型組比較，血清E2值略有升高。各類鼠血清培養(yǎng)誘導(dǎo)分化后的3T3-L1前脂肪細(xì)胞48 h后，左

圖1 2%各類鼠血清對3T3-L1前脂肪細(xì)胞P450arom mRNA表達(dá)的影響

3 討論

3.1 左歸丸與外源性雌激素作用于去勢雌鼠脂肪組織的機(jī)制可能不同 本研究發(fā)現(xiàn)左歸丸作用去勢雌性大鼠11周后，并不引起大鼠外周血中E2明顯升高;與模型組相比，有增加大鼠體重的趨勢，但無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。前期研究證實(shí)左歸丸對去勢大鼠子宮無明顯影響［18］，也說明左歸丸對雌激素靶器官的作用并非通過提高外周血中雌激素來實(shí)現(xiàn)。后續(xù)研究表明補(bǔ)腎中藥山茱萸內(nèi)所含成分齊墩果酸可明顯增加分化后的3T3-L1前脂肪細(xì)胞的E2分泌［19］，本研究也證實(shí)含左歸丸鼠血清培養(yǎng)分化中的3T3-L1前脂肪細(xì)胞，細(xì)胞上清液中E2值有升高的趨勢，說明左歸丸對3T3-L1前脂肪細(xì)胞生成E2有一定促進(jìn)作用。在機(jī)體內(nèi)，性腺外合成的雌激素是以旁分泌、細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外自分泌的方式作用于局部組織細(xì)胞［20-21］，局部的雌激素總量可能很少，但濃度高，生物學(xué)效應(yīng)強(qiáng)。推測左歸丸可能通過某種途徑作用于脂肪細(xì)胞，在一定程度上能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞增殖和分泌雌激素，但作用比較微弱。

很多研究認(rèn)為在未給予外源性雌激素的情況下，雄激素向雌激素的轉(zhuǎn)化與人體脂肪量、超重程度呈高度正相關(guān)［22］，肥胖者脂肪組織較多，激素的轉(zhuǎn)化也增多［23］。而本研究中給予外源性雌激素的去勢雌鼠，外周血E2遠(yuǎn)高于正常組、假手術(shù)組、模型組和中藥組，給藥前后體重差遠(yuǎn)低于正常組、假手術(shù)組、模型組和中藥組，說明循環(huán)雌激素較高的情況下可能會抑制脂肪細(xì)胞增殖。

3.2 左歸丸不增加3T3-L1前脂肪細(xì)胞的芳香化酶mRNA表達(dá)，可能通過增強(qiáng)芳香化酶的活性起作用

研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中的芳香化酶主要在未分化間充質(zhì)細(xì)胞中合成［22］。有學(xué)者認(rèn)為女性絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平降低而脂肪組織的芳香化酶表達(dá)增強(qiáng)［22］，芳香化酶的轉(zhuǎn)錄水平與酶活性無明顯相關(guān)，可能酶活性降低，而芳香化酶轉(zhuǎn)錄水平反而升高［23］。含左歸丸鼠血清培養(yǎng)誘導(dǎo)分化中的3T3-L1前脂肪細(xì)胞后，細(xì)胞P450arom的mRNA表達(dá)低于模型組，而細(xì)胞上清液中E2值升高，說明左歸丸不增加3T3-L1前脂肪細(xì)胞的芳香化酶mRNA表達(dá)，可使P450arom的活性增強(qiáng)。

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