白衛(wèi)濱，曹春廷，朱翠娟，文羅娜，吳賢權，歐仕益，孫建霞2，

1(暨南大學食品科學與工程系，廣州廣東，510632)2(廣東工業(yè)大學輕工化工學院，廣東廣州，510006)

目前，全世界范圍內很多種轉基因作物已經(jīng)商業(yè)化，如大豆、玉米、棉花、油菜以及番木瓜等，而對轉基因產(chǎn)品的安全性問題，還存在爭議。因此，部分國家為保障本國消費者知情權和貿易壁壘，要求對轉基因產(chǎn)品進行定性或定量標識。我國目前對轉基因產(chǎn)品采取強制定性標識政策，而定性標識的技術基礎是轉基因成分檢測方法的研究。目前，轉基因檢測方法有PCR 方法［1］、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)［2］、Western 雜交法［3］、近紅外光譜法［4］。應用最為廣泛的方法為PCR方法，已經(jīng)應用于多種轉基因產(chǎn)品的檢測，如土豆［5－6］、玉米［7－10］、大米［11－12］等。

番木瓜是一種亞熱帶水果，但由于易受環(huán)斑病毒的感染而影響其產(chǎn)量，科學家采用轉基因技術培育出抗環(huán)斑病毒的轉基因番木瓜，抗環(huán)斑病毒轉基因番木瓜品種主要有Event 55-1、GM-YK和華農一號，華農一號是我國自主研發(fā)的轉基因番木瓜，已批準進入?yún)^(qū)域商業(yè)化，目前盡管已經(jīng)建立了轉基因番木瓜檢測方法，但對華農一號快速篩選方法的建立仍需開展。目前已有多重PCR法同時檢測Event 55-1和非法轉基因品種［13］，實時熒光PCR 法研究 Event 55-1、GM-YK等非法轉基因品種的污染［14］及基因流動性研究［15］等，但對華農一號研究很少。姜大剛等［16］利用TAILPCR法測定出插入位點后利用定性PCR檢測華農一號，可達到0.05%的檢測限。韓建勛等［17］用實時熒光定量PCR對包括華農一號在內的4種轉基因產(chǎn)品進行研究，檢出了臺灣中興大學研發(fā)的4個轉基因品系。

但這些研究都只限于轉基因番木瓜華農一號的品系檢測，并不能同時對多種轉基因番木瓜品種進行檢測。因此本研究以華農一號為研究對象，通過對華農一號及另外2種已獲批準商業(yè)化種植的抗病毒轉基因番木瓜(Event 55-1、GM-YK)DNA的提取、通用引物及外源基因的設計、單重及多重PCR擴增技術研究，旨在建立針對轉基因番木瓜華農一號轉基因成分的簡便快速、高靈敏度的多重PCR技術。

1 材料與試劑

1.1 試劑和儀器

DP305植物基因組DNA提取試劑盒;Taq DNA聚合酶體系2×MasterMix(包括0.1 U Taq Polymerase/μL、500 μmol/L dNTP each、20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、其他穩(wěn)定劑和增強劑);DNA Marker DL 2000，購于 TIANGEN公司;紫外分光光度計，美國Thermo公司 ;微量移液器，美國Thermo公司;ABI 2720 thermal cycler，Applied Biosystems;PCR擴增儀;Gel Doc1000凝膠成相系統(tǒng)，美國Bio Rad公司。

1.2 材料

實驗材料采用3種轉基因番木瓜(Event 55-1、GM-YK和華農一號)和普通番木瓜(臺農2號)的新鮮葉片，并于－4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 實驗方法

2.1 DNA提取與純化

取各品種的新鮮番木瓜葉100 mg，加入液氮充分研磨，用DNA提取試劑盒提取DNA。采用紫外分光光度法測定DNA的濃度和純度。為了方便PCR的操作和計算，3種DNA樣品最后均稀釋到100 ng/μL。

2.2 特異性引物基因的設計

3種轉基因番木瓜的外源基因序列［17-18］(圖1～圖3)Papain(木瓜蛋白酶基因)是調控肽鏈內切酶和半胱氨酸蛋白酶的典型家族遺傳基因，可作為木瓜的內標基因［19-20］。由于外源基因的插入，3種轉基因番木瓜都有NPTⅡ(新霉素磷酸轉移酶II基因)和35s(35S啟動子)2種基因，RP(復制酶基因)僅存在于華農一號;CP(PRSV的外殼蛋白基因)僅存在于GM-YK和55-1兩種番木瓜，這種特殊的基因分布決定了PCR特異性引物驗證的實驗設計。

圖1 華農一號番木瓜外源基因Fig.1 Exogenous gene of papaya Huanong No.1

圖2 GM-YK番木瓜外源基因Fig.2 Exogenous gene of papaya GM-YK

圖3 55-1番木瓜外源基因Fig.3 Exogenous gene of papaya 55-1

根據(jù)3種轉基因番木瓜的外源基因序列，設計4種特異性引物(見表1)并采用番木瓜特有的木瓜蛋白酶基因(Papain)作為內參基因。利用NCBI引物設計軟件設計并從生工生物工程(上海)股份有限公司合成的5對引物對如表1所示。

表1 轉基因番木瓜內、外源基因的PCR引物Table 1 PCR primers for endogenous and exogenous gene of transgenic papaya

2.3 特異性引物單重PCR檢測研究

擴增采用反應體系為25 μL，含2×MasterMix(包括 0.1 U Taq Polymerase/μL、500 μmol/L dNTP each、20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、其他穩(wěn)定劑和增強劑)，10 mmol/L引物，DNA模板濃度均為20 ng/μL。

單重擴增程序為:預變性(94℃，3 min);30個循環(huán):變性(94 ℃，30 s)，退火(60 ℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);終止延伸(72 ℃，5 min)。

多重PCR反應對擴增儀的設置為:預變性(94℃，3 min);30個循環(huán):變性(94℃，30sec)，退火(62℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);終止延伸(72℃，5 min)。反應體系為 25 μL。

反應結束后取5 μL PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中，穩(wěn)壓80 V電泳30 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下檢測。

2.4 特異性引物多重PCR驗證

多重PCR反應對擴增儀的設置為:預變性(94℃，3 min);30個循環(huán):變性(94℃，30 s)，退火(62℃，30 s)，延伸(72℃，1 min);終止延伸(72 ℃，5 min)。反應體系為25 μL。其中，引物用量初始設計為1 μL(濃度為10 mmol/L)，經(jīng)過反復驗證，在五重PCR體系中進行了優(yōu)化，獲得了最終的多重PCR體系(見表2)。

反應結束后取5 μL PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中，穩(wěn)壓80 V電泳30 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下檢測。

2.5 特異性引物的PCR擴增靈敏度分析

在五重PCR體系的基礎上進行靈敏度分析，設置華農一號DNA模板的體系濃度梯度分別為100、20、5、1、0.2、0.05 ng，不改變 PCR 擴增儀的程序進行擴增，獲取結果。

表2 五重PCR反應體系Table 2 Reaction system of fivefold PCR

3 結果與分析

3.1 不同轉基因番木瓜DNA引物的特異性檢測

本研究的引物是通過NCBI網(wǎng)站引物設計軟件設計，通過數(shù)據(jù)庫比對，篩選轉基因番木瓜的特異性基因，進而根據(jù)該特異性基因確定特異性擴增引物，從理論上保證了引物的特異性，使其能在基因水平上反映種類的差異。

而在實驗前期，采用番木瓜，蘋果、橙子、草莓、芒果、梨、桃子、桑葚等常見水果品種進行了引物特異性的驗證，發(fā)現(xiàn)設計的引物均有高度特異性，可應用于轉基因番木瓜的鑒偽研究［21］。5對引物的PCR特異性驗證電泳結果如圖4所示。

圖4 單引物PCR驗證Fig.4 Verification of single primer PCR

由圖1可知，各組引物都能擴增出單一的條帶，其中CP引物可特異性對GM-YK和55-1兩種轉基因番木瓜進行擴增，得到單一條帶，大小為103 bp;35s引物可特異性對華農一號和55-1兩種番木瓜進行擴增，得到單一條帶，大小為166 bp;NPTII引物可特異性對華農一號和55-1兩種番木瓜進行擴增，得到單一的條帶，大小為213 bp;Papain引物可特異性對轉基因華農一號和非轉基因臺農2號2種番木瓜進行擴增，均得到單一的條帶，大小為281 bp。RP引物可特異性只對轉基因華農一號進行擴增，選擇華農一號2種品種擴增都可得到單一條帶，大小為369 bp。綜上可得，5對引物的特異性均良好，可用于后續(xù)研究。

3.2 轉基因番木瓜多重PCR引物特異性檢測結果分析

多重PCR相對于單重PCR具有更高的檢測效率，簡便快捷且同時可以節(jié)約時間和資源，而且也能保持較高的靈敏度與準確性，值得深入研究［22］。本研究采用逐個增加特異性引物的方法，依次進行1-5重PCR擴增，得到1-5重的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖5。

圖5 1-5重PCR擴增結果Fig.5 Amplification results of multiple PCR

由圖5可見，Papain引物和35s引物所在的1、2號條帶清晰可見，大小分別為281 bp與166 bp，特異性表現(xiàn)良好;3號是在35s引物的基礎上增加了NtpII引物，結果均出現(xiàn)較清晰的條帶，NtpII大小為213 bp;4號為3重PCR，在3號基礎上增加了Papain引物，擴增所得的3組條帶均較為清晰可見;5號與6號條帶分別選用了2種轉基因番木瓜進行四重PCR的驗證，由于華農一號不具備CP片段基因，而GM-YK轉基因番木瓜含有除RP片段基因外的其余4種基因，故選用GM-YK作為包含CP基因的四重PCR檢測中的實驗材料，結果顯示，增加了CP基因后，4條條帶(Papain、35s、NtpII和 CP)仍清晰可見，其中CP大小為103 bp;6號在4號PCR結果的基礎上增加了 RP引物，四條條帶(Papain、35s、NtpII213和RP)仍清晰可見，其中RP大小為369 bp。

7號作為5重PCR體系的結果為，在含有華農一號與GM-YK 2種DNA模板的體系中，5種引物均擴增出了較為清晰的條帶，條帶大小也與各引物的特異性驗證中的結果相一致。

3.3 轉基因番木瓜多重PCR檢測的靈敏度

為了驗證轉基因番木瓜類特異性引物五重PCR靈敏性，設置華農一號DNA模板的體系濃度梯度分別為 100、20、5、1、0.2、0.05 ng，以這些 DNA 樣品為模板進行擴增。靈敏度驗證結果如圖6所示。擴增得到華農一號應有的4條條帶，擴增效率隨模板量減少而降低，同時條帶的清晰度也隨之下降，當模板量減少至0.05 ng時，已得不到目的條帶。所以，該五重PCR的檢測限為0.2 ng目標DNA。

圖6 五重PCR靈敏度驗證Fig.6 Verification of sensitivity of five-plex PCR

4 討論

多重PCR具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟簡便性等特點，但成功的實現(xiàn)多重PCR并非易事。多重PCR在擴增過程中會遇見多個靶點擴增條件不兼容的問題，因此引物的設計及反應條件摸索極為重要。本文通過內源基因木瓜蛋白酶基因的使用和對3種轉基因番木瓜外源基因特有基因分布研究，得到五對特異性引物，成功進行了特異性擴增。在進行五重PCR研究過程中，采用逐個增加引物的方法，并同時對反應條件，引物配比等影響多重PCR擴增的條件進行反復實驗，最終實現(xiàn)五重PCR擴增。首次進行了以華農一號為研究對象的多重PCR研究，并建立了檢測番木瓜中轉基因成分的五重PCR技術，檢測限為0.2 ng，達到了華農一號轉基因番木瓜快速篩選的目的。

［1］ XU J，ZHU S F，MIAO H Z，et al.Event-specific detection of seven genetically modified soybean and maizesusingmultiplex-PCR coupled with oligonucleotide microarray［J］.Food Chemistry，2007，55(14):5 575－5 579.

［2］ Roda A，Mirasoli M，Guardigli M，et al.Development and validation of a sensitive and fast chemiluminescent enzyme immunoassay for the detection of genetically modified maize［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2006，384(6):1 269－1 279.

［3］ Bulcke M V D，Schrijver A D，Bernardi D D，et al.Detection of genetically modified plant products by protein strip testing:an evaluation of real-life samples［J］.European Food Research and Technology，2007，225(1):43－57.

［4］ XIE L J，YING Y B，YING T J，et al.Discrimination of transgenic tomatoes based on visible/near-infrared spectra［J］.Analytica Chimica Acta，2007，584(2):379 －384.

［5］ Akiyama H，Watanabe T，Wakui C，et al.A detection method for recombinant DNA from genetically modified potato(NewLeaf Y potato)［J］.ShokuhinEiseigakuZasshi，2002，43(5):301－305.

［6］ Akiyama H，Sugimoto K，Matsumoto M，et al.A detection method of recombinant DNA fromgenetically modified potato(NewLeaf Plus potato)and detection of NewLeaf Plus potato in snack［J］.ShokuhinEiseigakuZasshi，2002，43(1):24－29.

［7］ Akiyama H，Sakata K，Kondo K，et al.Individual detection of genetically modified maize varieties in non-identitypreserved maize samples［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2008，56(6):1 977－1 983.

［8］ Matsuoka T，Kawashima Y，Akiyama H，et al.A method of detecting recombinant DNAs from four lines of genetically modified maize［J］.Shokuhin Eiseigaku Zasshi，2000，41:137－143.

［9］ Matsuoka T，Kuribara H，Akiyama H，et al.A multiplex PCR method of detecting recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize［J］.ShokuhinEiseigaku-Zasshi，2001，42(1):24 －32.

［10］ Matsuoka T，Kuribara H，Suefuji Y，et al.A detection method for recombinant DNA from genetically modified maize CBH351［J］.ShokuhinEiseigakuZasshi，2001，42:197－201.

［11］ Akiyama H，Sasaki N，Sakata K，et al.Indicated detection of two unapproved transgenic rice lines contaminating vermicelli products［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(15):5 942－5 947.

［12］ Nakamura K，Akiyama H，Kawano N，et al.Evaluation of real-time PCR detection methods for detecting rice products contaminated by rice genetically modified with a CpTI– KDEL – T-nos transgenic construct［J］.Food Chemistry，2013，141(3):2 618－2 624.

［13］ Erika M W，Tracy S L，Margaret J G，et al.Detection and identification of transgenic virus resistant papaya and squash by multiplex PCR［J］.European Food Research and Technology，2004，219(1):90－96.

［14］ Nakamura K，Kondo K，Kobayashi T，et al.Identification and detection ofgenetically modified papaya resistant to papaya ringspot virus strains in Thailand［J］.The Pharmaceutical Society of Japan，2014，37(1):1－4.

［15］ Madhugiri N R，Charles K，Sujata A，et al.Sensitivity of a real-time PCR method for the detection of transgenes in a mixture of transgenic and non-transgenic seeds of papaya(Carica papaya L.)［J］.BMC Biotechnology，2013，13:1－11.

［16］ 姜大剛，周峰，姚涓，等.轉基因番木瓜“華農一號”事件特異性定性PCR檢測方法的建立［J］.華南農業(yè)大學學報，2009(30):37－41.

［17］ 韓建勛，陳紅運，鄧婷婷，等.抗病毒轉基因番木瓜的實時 PCR檢測［J］.檢驗檢疫科學，2010(1):15－20.

［18］ Wall E M，Lawrence T S，Green M J，et al.Detection and identification of transgenic virus resistant papaya and squash by multiplex PCR［J］.European Food Research and Technology，2004，219(1):90－96.

［19］ 徐瑗聰.一種以木瓜蛋白酶為內標基因的轉基因番木瓜定性及定量PCR檢測方法［J］.農業(yè)生物技術學報，2013，21(12):1521－1521.

［20］ FAN M J，CHEN S，KUNG Y J，et al.Transgene-specific and event-specific molecular markers for characterization of transgenic papaya linesresistantto Papaya ringspotvirus［J］.Transgenic Research，2009，18(6):971－986.

［21］ 孫建霞，白衛(wèi)濱，曹春廷，等.蘋果汁和桃汁種類特異性PCR檢測方法的研究［J］.食品工業(yè)科技，2014(7):288－291.

［22］ Edwards M C，Gibbs R A.Multiplex PCR:advantages，development，and applications［J］.Genome Research，1994，3(4):S65－S75.