胡玲萍，裘迪紅，王鑫鈺

1(寧波大學(xué)，浙江寧波，315211)2(浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，浙江杭州，310053)

泡菜發(fā)酵過(guò)程中有多種微生物參與，乳酸菌作為優(yōu)勢(shì)菌種，在泡菜的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中起到非常重要的作用［1－3］。Pederson 和 Albury 等［4－5］發(fā)現(xiàn)，在酸白菜、酸黃瓜等泡菜的發(fā)酵早期明串珠菌非?；钴S，接著是短乳桿菌、啤酒片球菌和植物乳桿菌大量產(chǎn)酸，最后是植物乳桿菌結(jié)束發(fā)酵過(guò)程。乳酸菌胞外產(chǎn)物很多，目前研究的大多是胞外多糖的性質(zhì)［6］，而對(duì)胞外蛋白酶研究較少。乳酸菌胞外酶通過(guò)水解作用，使多糖、蛋白質(zhì)、核酸等天然高聚物裂解，逐步變?yōu)榭纱┻^(guò)細(xì)胞質(zhì)膜而被吸收利用的小分子物質(zhì)，通常1株乳酸菌菌株可以分泌一種或多種胞外蛋白酶［7－8］。溫度、pH、金屬離子、有機(jī)物等因素都會(huì)影響胞外酶的活性。

在實(shí)際生產(chǎn)中，乳酸菌一般被認(rèn)為是安全的細(xì)菌(generally regarded as safe，GRAS)［9，因此乳酸菌在食品中應(yīng)用時(shí)可省去后提取等繁瑣工藝從而提高經(jīng)濟(jì)效益。乳酸菌作為發(fā)酵菌種的幾個(gè)重要指標(biāo)能力分別是:產(chǎn)酸能力，產(chǎn)香能力，蛋白質(zhì)水解能力，產(chǎn)生帶有黏性的胞外多糖能力以及抑菌能力。因此，篩選用于發(fā)酵食品的菌株應(yīng)符合食品的全面的感官性質(zhì)，在考慮產(chǎn)酸速度和產(chǎn)酸量的同時(shí)，還要注意對(duì)發(fā)酵乳制品風(fēng)味有重要影響的風(fēng)味化合物的形成［10］。

本研究從傳統(tǒng)發(fā)酵泡菜中分離乳酸菌，通過(guò)脫脂牛乳平板試驗(yàn)并結(jié)合福林酚法測(cè)定蛋白酶活力，篩選出高產(chǎn)蛋白酶菌株，從中提取胞外蛋白酶并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了初步的研究，目的是通過(guò)了解其蛋白質(zhì)的水解能力，為該乳酸菌發(fā)酵劑的制備提供理論依據(jù)，為泡菜中植物乳酸菌胞外蛋白酶在新型發(fā)酵行業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

從傳統(tǒng)泡菜中分離得到的乳桿菌。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

CaCO3、福 林 酚 試 劑、NaH2PO4· 12H2O、Na2HPO4·12H2O、Na2CO3、三氯醋酸(TCA);酸化MRS瓊脂培養(yǎng)基、脫脂牛乳平板、MRS肉湯;dNTP、TapDNA聚合酶、10×buffer、Mg2+等，大連寶生物公司;PCR產(chǎn)物回收試劑盒、氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)、胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)、NaCl、瓊脂粉、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)R-250、葡聚糖Sephadex-75等，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

H-205R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;QHZ-12A組合式恒溫振蕩培養(yǎng)箱;紫外分光光度計(jì)，上海瀘西分析儀器廠有限公司;LDZX-50KB立式高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;DYY-Ⅲ垂直板電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 泡菜中乳桿菌的分離純化

將泡菜汁進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取適宜的稀釋度，用經(jīng)滅菌并冷卻到45～50℃的含有Ca2CO3的酸化MRS瓊脂培養(yǎng)基傾倒平板，30℃培養(yǎng)48 h，挑取有溶鈣圈的菌落，在MRS平板上反復(fù)劃線，直到得到單菌落;在平板上劃線分離，反復(fù)純化，經(jīng)革蘭氏染色，挑出革蘭氏陽(yáng)性菌。

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶乳桿菌的初篩

將實(shí)驗(yàn)室從泡菜中分離得到的乳桿菌菌株進(jìn)行復(fù)壯，然后各取10 mL培養(yǎng)液5 000 r/min離心10 min，取50 μL上清液添加到脫脂牛乳瓊脂培養(yǎng)基的孔里，孔徑為6.0 mm，隨后將其置于35℃培養(yǎng)48 h，最后挑選出在脫脂牛乳平板上產(chǎn)生透明圈較大的乳桿菌保存，每株乳桿菌進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)［11］。

1.2.3 產(chǎn)蛋白酶乳桿菌的復(fù)篩

將初篩選擇的菌株接種至20 mL新鮮的MRS肉湯于35℃培養(yǎng)72 h，取5 mL發(fā)酵液于8 000 r/min、4℃下離心20 min，所收集的上清液即為粗酶液，進(jìn)行蛋白酶活力的測(cè)定。每株菌進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值。確定高產(chǎn)蛋白酶的乳桿菌株［10］。

1.2.4 蛋白酶活力的測(cè)定

粗酶液和純化的酶液都采用福林酚法［13］測(cè)定蛋白酶活性。在680 nm處測(cè)定樣品酶液的吸光值，進(jìn)而換算成蛋白酶活性。蛋白酶活性單位定義為:1 mL酶液在40℃、pH7.5的條件下，每分鐘催化分解蛋白質(zhì)生成1 μg酪氨酸所需的酶量為1個(gè)酶活性單位，以U/mL表示。

1.2.5 菌株L4的PCR鑒定

實(shí)驗(yàn)直接用菌體作為模板，不進(jìn)行基因組DNA的提取步驟。用無(wú)菌移液器挑取適量活化后的單菌落L4，加入20 μL PCR水中，充分振蕩后稍離心，作為PCR模板，反應(yīng)體系見表1。

PCR循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性3 min，94℃ 60 s(變性)，50 ℃ 60 s(退火)，72 ℃ 120 s(延伸)，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。反應(yīng)完畢取5 μL反應(yīng)液進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下分析結(jié)果。

表1 PCR反應(yīng)體系Table 1 The components of PCR reaction

目的片段與載體的連接:參照大連寶生物工程有限公司的pMD18-T Vector試劑盒說(shuō)明書。在微量離心管中配制下列連接反應(yīng)體系(見表2)，16℃下過(guò)夜。

表2 連接反應(yīng)體系Table 2 The components of ligation reaction

重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化:將5 μL的過(guò)夜連接反應(yīng)液加入到30 μL感受態(tài)細(xì)胞中，在冰中靜置30 min，42℃水浴45 s，再冰中靜置1min，加入300 μL LB(Amp－)培養(yǎng)液，37℃、140 r/min搖床培養(yǎng)60 min。

陽(yáng)性克隆的初步篩選:將120 μL菌液加入含有Amp的LB瓊脂平板，均勻涂布，待完全吸收后倒置于37℃培養(yǎng)箱中，12～16 h后觀察有無(wú)白色單菌落生長(zhǎng)。

PCR法直接篩選重組陽(yáng)性克隆:PCR反應(yīng)體系擴(kuò)大到150 μL和反應(yīng)程序與PCR擴(kuò)增相同，產(chǎn)物做凝膠電泳檢測(cè)以篩選重組陽(yáng)性克隆。

序列測(cè)定:將經(jīng)過(guò)鑒定符合的陽(yáng)性菌落加到含Amp的LB培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)，加甘油保存菌液，由上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)定序列。

1.2.6 植物乳桿菌胞外蛋白酶的提取

將發(fā)酵液4 500 r/min離心12 min后除去菌體，測(cè)上清液pH值。用0.22 μm/0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液存放于－20℃冰箱中備用。將上述培養(yǎng)過(guò)濾液取出置室溫融化后，緩慢加入(NH4)2SO4粉末至80%飽和度，4℃過(guò)夜，10 000 r/min離心15 min，收集沉淀。將沉淀溶解于40 mL 0.02 mol/L pH7.8的Tris-HCl緩沖液，4℃透析24 h(每8 h換透析液1次)，12 000 r/min離心20 min，上清液即為粗蛋白液，其間充分換水并攪動(dòng)。

1.2.7 胞外蛋白酶純化

將收集的上述酶溶液充分透析，并用PAEG濃縮至體積為6 mL左右，然后加入到用0.02 mol/L pH7.8 Tris-HCl平衡的Sephadex G-75柱，用相同緩沖液洗脫，流速15 mL/h，每管1 mL收集洗脫液，測(cè)定蛋白吸收和酶活力。收集酶活力集中部分，冷凍干燥。

1.2.8 胞外蛋白酶分子量確定

將SDS-聚丙烯酰胺凝膠裝配好，注入足量的SDS-PAGE電泳緩沖液;取20 μL樣品加入5 μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻;于沸水浴中處理2～5 min;離心 (10 000 g，1 min)，取20 μL 上清液加到加樣孔中;將電壓調(diào)至160 V(恒壓)，當(dāng)染料電泳至底部即可停止。

將電泳完畢的凝膠轉(zhuǎn)移至干凈的中型培養(yǎng)皿，加入20 mL考馬斯亮藍(lán)染色液，室溫緩慢振蕩15～20 min(適當(dāng)加熱可加速)，傾去染色液，蒸餾水洗1次;加入50 mL脫色液，于室溫緩慢振蕩20～30 min或直至脫色完全為止。

1.2.9 胞外蛋白酶酶學(xué)特性分析

經(jīng)過(guò)純化的ECPase于55、100℃下分別處理5、10、20、35、50 min，測(cè)定酶活力。將 ECPase 分別于在0，20，30，37，50，56，60，70，80，90 和 100 ℃ 下處理 1 h，再測(cè)定其酶活性，繪制酶活性變化曲線。

分別用pH 2.2的碳酸氫鈉－檸檬酸緩沖液，pH 11.0的甘氨酸－氫氧化鈉緩沖液，pH 8.0的Tris-HCl緩沖液配成 pH 值分別為 2.5，3，4，5，6，6.5，7，7.5，8，9，10，11 的緩沖液，加純化的 ECPase，測(cè)活力變化曲線。

選擇性抑制劑50 mmol/L金屬螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)、100 mmol/L絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)與純酶液以1∶1(V/V)混合，于26℃溫浴1 h后，以1%的酪蛋白為底物，15%的三氯乙酸終止反應(yīng)，測(cè)酶活性。

將濃度為 1 mmol/L 的 CoCl2、ZnSO4、MnCl2、BaCl2、FeCl3、CuSO4及 MgCl2等金屬鹽溶液分別和ECPase作用，32℃下處理0.5 h，再測(cè)定其酶活性。對(duì)照組為不加金屬鹽的ECPase樣品，空白則為經(jīng)過(guò)沸水浴滅活的樣品。

2 結(jié)果

2.1 泡菜中乳桿菌的分離結(jié)果

通過(guò)平板分離培養(yǎng)，從酸化MRS培養(yǎng)基上挑取產(chǎn)生Ca2CO3溶解圈，乳白色或黃色，菌落直徑1～3 mm，表面光滑，邊緣較整齊的菌落在MRS培養(yǎng)基上反復(fù)劃線，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。選擇G+菌，呈桿狀，以單生、成對(duì)或短鏈排列的菌株，從而共分離出16株，分別標(biāo)記為L(zhǎng)1－L16，保藏于斜面。

2.2 產(chǎn)蛋白酶乳桿菌的篩選

通過(guò)脫脂牛乳平板試驗(yàn)，從分離得到的16株乳桿菌菌株中篩選出12株產(chǎn)蛋白酶乳桿菌，結(jié)果見圖1。

圖1 脫脂乳平板上產(chǎn)生的透明圈Fig.1 The transparent circles on skim-milk culture

將初篩得到的12株產(chǎn)蛋白酶的菌株按1.2.4的方法培養(yǎng)，采用福林酚法測(cè)定其蛋白酶活性，結(jié)果如表3所示。不同的菌株產(chǎn)蛋白酶活性存在差異，其中尤其以L4菌株的蛋白酶活性最高，達(dá)到25.12 U/mL。因此，本研究以L4菌株作為研究菌株，并對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定。

表3 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選結(jié)果Table 3 Results of screening of the protease-producing bacterial strains

2.3 菌株L4的PCR鑒定

2.3.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

以L4菌體為模板，利用引物:5’-GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAA-3’和 5’-GTGATC-CAGCCGCAGGTTCTCC-3’對(duì)L1的16S rDNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，PCR反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物分子量在800bp左右，符合16S rDNA片段大小，說(shuō)明所選用的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序都可達(dá)到預(yù)期目的。

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR product

2.3.2 PCR產(chǎn)物重組陽(yáng)性克隆的篩選

從圖3凝膠成像圖中可以看出，PCR反應(yīng)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量在800 bp左右，且擴(kuò)增效果較好，證明所挑取的克隆菌確實(shí)含有插入的目的片段，說(shuō)明本次克隆操作是成功的，沒有發(fā)生污染。

2.3.3 測(cè)序結(jié)果

使用NCBI網(wǎng)站對(duì)該菌的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各種菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，并使用BLAST在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性搜索，發(fā)現(xiàn)該菌株的堿基序列與多株植物乳桿菌(JX025073.1、JQ236622.1、JN680707.1、AB362759.1、EU559598.1 等)相應(yīng) 16S rDNA序列99%相似，可以鑒定L4為植物乳桿菌。

2.4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)蛋白酶活力的影響

將L4菌株接種于MRS培養(yǎng)基，置于30℃培養(yǎng)48 h，并且在培養(yǎng)時(shí)間為4、8、12、16、20 和24 h 處測(cè)其粗蛋白酶活力。結(jié)果如圖5所示。

隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株產(chǎn)生的蛋白酶活力不斷增強(qiáng)，在20 h左右達(dá)到最高，此后呈下降趨勢(shì)。

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)蛋白酶的影響Fig.5 Effect of culture time on protease production

2.5 胞外蛋白酶分子量確定

電泳完畢后的凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色液染色、脫色液脫色后用凝膠成像儀成像分析，確定胞外蛋白酶的分子量為40 kDa。成像后的圖片見圖6。

圖6 純化ECPase的PAGE圖譜Fig.6 PAGE electrophore-togram of the purified ECPase

2.6 酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用福林酚法在680 nm處測(cè)OD值建立胞外蛋白酶酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.006X+0.002(R2=0.999)。

2.7 pH對(duì)胞外蛋白酶酶活性的影響

將胞外蛋白酶在37℃與不同pH緩沖液都作用1 h，用福林酚法測(cè)蛋白酶680 nm處OD值，繪制酶活力曲線。從圖7可以看出胞外蛋白酶的最適pH為9，pH低于5或高于10酶活性受到很大影響，處于一個(gè)較低水平。

圖7 pH對(duì)ECPase活性的影響Fig.7 Effect of pH on activity of ECPase

2.8 溫度對(duì)胞外蛋白酶活性影響

純化的ECPase在pH9條件下，55、100℃分別處理5、10、20、35、50 min 后發(fā)現(xiàn) ECPase在 55 ℃ 下作用50 min，其活性并沒有大幅度的下降，但在100℃下處理30 min后其活性則基本喪失。將ECPase分別在 0、20、30、37、50、56、60、70、80、90 和 100 ℃下處理1 h，再測(cè)定其酶活性，繪制酶活性變化曲線(圖8)，結(jié)果表明酶活性于50～60℃最佳，溫度過(guò)低過(guò)高酶活性都將降低。

圖8 溫度對(duì)ECPase活性的影響Fig.8 Effect of temperature on activity of ECPase

2.9 金屬離子對(duì)胞外蛋白酶活性影響

將濃度為 1 mmol/L 的 CaCl2、ZnSO4、MnCl2、BaCl2、FeCl3、CuSO4及 MgCl2等金屬鹽溶液分別和純化的ECPase作用，32℃下處理0.5 h，再測(cè)定其酶活性。結(jié)果如圖10所示，Mg2+、Cu2+對(duì)胞外蛋白酶活力影響不大，其他離子對(duì)胞外蛋白酶均有不同程度的抑制作用。

圖9 金屬離子對(duì)ECPase活性的影響Fig.9 Effect of metal anions on activity of ECPase

2.10 抑制劑對(duì)胞外蛋白酶活性影響

純酶液與選擇性抑制劑以1∶1(V/V)混合，于26℃溫浴1 h后，測(cè)680 nm處OD值，計(jì)算蛋白酶活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，PMSF對(duì)胞外蛋白酶活力影響不大，而DETA則能大大降低蛋白酶活力。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)泡菜中分離得到16株乳桿菌，通過(guò)脫脂乳平板試驗(yàn)篩選出12株產(chǎn)蛋白酶的菌株，結(jié)合福林酚法測(cè)定12株乳桿菌分泌的蛋白酶活力。其中以菌株 L4產(chǎn)蛋白酶活力最高，粗酶活力可達(dá)25.12 U/mL。利用分子生物學(xué)方法對(duì)該菌株進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，該菌株的堿基序列與多株植物乳桿菌(JX025073.1、JQ236622.1、JN680707.1、AB362759.1、EU559598.1等)相應(yīng)的16S rDNA序列99%相似，可以鑒定其為植物乳桿菌。由純化的胞外蛋白酶的圖譜可以得出該胞外蛋白酶的分子量為40 kDa。胞外酶活力最適pH為9，在50～60℃范圍酶較穩(wěn)定，該胞外蛋白酶在55℃下作用50 min，其活性并沒有大幅度的下降，但在100℃下處理30 min后其活性才基本喪失。抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ca2+、Ba2+、Zn2+、EDTA能大大抑制該蛋白酶活性，而 Mg2+、Mn2+、Cu2+、PMSF 對(duì)胞外蛋白酶活力影響不大。

圖10 抑制劑對(duì)ECPase活性的影響Fig.10 Effect of Inhibitor on activity of ECPase

植物乳桿菌屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，兼性異型乳酸發(fā)酵。據(jù)資料研究表明植物乳桿菌在乳中發(fā)酵存在一些生長(zhǎng)限制因子，幾乎不能在乳中單獨(dú)生長(zhǎng)繁殖、發(fā)酵產(chǎn)酸。其中的原因可能是植物乳桿菌不編碼細(xì)胞壁蛋白水解酶，植物乳桿菌存在OPP和DTPT轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和一些胞內(nèi)肽酶(內(nèi)肽酶，氨肽酶，脯氨酸特異性酶，二肽酶，三肽酶)，由于植物乳桿菌缺乏細(xì)胞壁表面的蛋白水解酶，不能很好利用酪蛋白，因此在牛乳發(fā)酵中周期較長(zhǎng)［15］。目前，植物乳桿菌在發(fā)酵乳制品中的應(yīng)用僅限于將植物乳桿菌作為輔助菌株，與干酪發(fā)酵劑同時(shí)加入促進(jìn)干酪風(fēng)味形成或增加產(chǎn)品益生功能。因此，利用本實(shí)驗(yàn)得到的高產(chǎn)蛋白酶的植物乳桿菌制成發(fā)酵劑發(fā)酵蛋白質(zhì)食品，可以使蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)被降解成氨基酸等有利于人體吸收的小分子物質(zhì)，提高食物營(yíng)養(yǎng)資源的利用率。因此，本實(shí)驗(yàn)的研究可以為充分發(fā)掘傳統(tǒng)發(fā)酵食品中豐富的微生物資源，制備優(yōu)質(zhì)發(fā)酵劑打下基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

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