楊慶勝，閆玉潔，馬洋，李會(huì)，史勁松

(江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)

微生物多糖是由微生物細(xì)胞合成的一種糖類高分子聚合物，可分為胞內(nèi)多糖、胞外多糖和結(jié)合多糖3種。胞外多糖具有純度高、產(chǎn)量大、提取簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用也最為廣泛，目前在食品、日化、制藥和廢水處理等多個(gè)行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用［1］。

膠質(zhì)芽孢桿菌最早由 Passik首次分離［2］，其在特定的生長(zhǎng)狀態(tài)下能夠合成大量莢膜多糖［3］，這種多糖的生成與膠質(zhì)芽孢桿菌的解磷、解鉀、礦化脫硅等功能密切相關(guān)［4－6］。提取后的胞外多糖還可作為生物絮凝劑、陶瓷行業(yè)的添加劑等［7］。此外，還有研究表明，膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖有顯著改善免疫力作用，作為高分子組織材料有著良好的開發(fā)前景［8］。

通過(guò)深層發(fā)酵培養(yǎng)可以大量獲取膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖，目前在優(yōu)化的工藝條件下，可以達(dá)到24 g/L的產(chǎn)量［9］。培養(yǎng)基中的碳源，不僅作為菌體生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且是多糖碳架的前體物質(zhì)，提供充足的、容易代謝和利用的碳源，是合成大量胞外多糖的必要條件。而一次性在培養(yǎng)基中添加大量碳源，會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到抑制，并影響體系的傳質(zhì)和溶氧，使多糖產(chǎn)量顯著下降［10］。通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝可在一定程度上避免底物抑制，提高多糖產(chǎn)量和糖質(zhì)轉(zhuǎn)化效率［11］，但需要對(duì)初始糖濃度、補(bǔ)料時(shí)間進(jìn)行選擇，使多糖的發(fā)酵產(chǎn)率和碳源轉(zhuǎn)化效率趨于優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及試劑

菌株Bacillus mucilaginosus SM-01，保藏于中國(guó)菌種保藏中心(CGMCC5766);HCl、無(wú)水乙醇、葡萄糖、尿素、CaCO3、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O 及 NaCl等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 10.0，K2HPO4·3H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.2，尿素 0.1，CaCO35.0，瓊脂 20，pH 7.0 ～7.2。

(2)種子培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 10.0，K2HPO4·3H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.2，尿素 0.1，CaCO35.0，pH 7.0 ～7.2。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖60.0，K2HPO4·3H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.6，NaCl 0.4，尿素 0.3，CaCO35.0，pH 7.0 ～7.2。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

722型分光光度計(jì)，尤尼可上海儀器有限公司;CR22GⅡ冷凍高速離心機(jī)，日本日立公司;SPX-250型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;生物傳感分析儀SBA-40D，山東省科學(xué)院生物研究所;5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 膠質(zhì)芽孢桿菌的培養(yǎng)

種子培養(yǎng):將斜面菌種劃線于平板，30℃活化培養(yǎng)24 h，再用接種環(huán)挑取2環(huán)已活化的菌種轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將種子液4 mL接入裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃、150 r/min培養(yǎng)。

5 L發(fā)酵罐培養(yǎng):將120 mL種子液接入5 L發(fā)酵罐，裝液量3.0 L，培養(yǎng)溫度30℃，通氣量6 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min。

1.3.2 測(cè)定方法

菌體濃度測(cè)定:取1 mL發(fā)酵液，加入等體積2%HCl，混勻，再稀釋5倍，于600 nm測(cè)定吸光值(OD)。

葡萄糖濃度測(cè)定:取1 mL發(fā)酵液，稀釋100倍，然后12 000 r/min離心5min，取上清液，用生物傳感分析儀測(cè)定。

粗多糖濃度測(cè)定:取1 mL發(fā)酵液，稀釋10倍后，12 000 r/min離心20 min，取上清液，加入3倍體積無(wú)水乙醇，混勻，4℃沉淀10 h。8 000 r/min離心10 min，棄上清液得粗多糖。將粗多糖真空干燥至恒重，以分析天平稱重。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始葡萄糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)糖的影響

為選擇發(fā)酵培養(yǎng)基適宜的初始葡萄糖濃度，分別考察葡萄糖質(zhì)量濃度為 10，20，30，40，50，60，70 g/L時(shí)膠質(zhì)芽孢桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)糖情況(圖1)。

圖1 不同初始葡萄糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和多糖濃度的影響Fig.1 Effects of different initial glucose concentration on cell growth and polysaccharide concentration

結(jié)果表明，初始葡萄糖濃度為10 g/L時(shí)，菌體濃度(OD600)最高，為4.41，而初始葡萄糖濃度為60 g/L時(shí)，胞外多糖濃度最高，為28.11 g/L，可見菌體生長(zhǎng)和胞外多糖合成所需葡萄糖最適濃度并不相同。當(dāng)初糖濃度為30 g/L或更高時(shí)，菌體生長(zhǎng)明顯變差，且葡萄糖轉(zhuǎn)化效率降低。綜合考慮多糖濃度葡萄糖轉(zhuǎn)化率及菌體生長(zhǎng)情況，以初始葡萄糖濃度為60 g/L效果較好，此時(shí)菌體生長(zhǎng)情況及葡萄糖轉(zhuǎn)化率并非最優(yōu)，但多糖濃度達(dá)到最高，故選擇60 g/L作為下一步補(bǔ)料分批發(fā)酵的最優(yōu)初始葡萄糖濃度。

從提高葡萄糖轉(zhuǎn)化率角度分析，較低的或較高的初始葡萄糖濃度均不適宜，20～40 g/L是較為合適的濃度。為進(jìn)一步比較不同初始葡萄糖濃度下的菌體生長(zhǎng)速率、多糖合成速率，為補(bǔ)糖策略提供依據(jù)，實(shí)驗(yàn)詳細(xì)測(cè)定了20，30，40 g/L三種濃度下的菌體濃度、多糖濃度的過(guò)程數(shù)據(jù)，通過(guò)不同批次的比生長(zhǎng)速率、多糖比合成速率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在3種濃度下，盡管初始比生長(zhǎng)速率有所差異，但在12 h后基本接近(圖2)。不同初始葡萄糖濃度對(duì)多糖比合成速率影響較大(圖3)，當(dāng)初糖濃度為30 g/L，發(fā)酵前36 h產(chǎn)物比合成速率較高，之后，可能由于體系中糖濃度的降低(36 h時(shí)殘存葡萄糖濃度為11 g/L，60 h耗盡)，使產(chǎn)物合成速率開始降低。因此，要使產(chǎn)物合成速率保持較高的水平，需要向體系進(jìn)行糖質(zhì)補(bǔ)充。

圖2 初始葡萄糖濃度對(duì)菌體比生長(zhǎng)速率的影響Fig.2 Effects of different initial glucose concentration on specific cell growth rate

圖3 初始葡萄糖濃度對(duì)產(chǎn)物比合成速率的影響Fig.3 Effects of different initial glucose concentration on specific polysaccharide formation rate

2.2 補(bǔ)糖策略確定

胞外多糖合成需要大量碳源，但其濃度較高則會(huì)抑制多糖合成。微生物胞外多糖合成會(huì)受到高濃度速效碳源阻遏［12－13］，通過(guò)補(bǔ)料來(lái)控制其濃度即可解除這種阻遏。微生物胞外多糖合成一般分兩個(gè)階段:前期菌體繁殖階段及后期多糖積累階段。發(fā)酵前期可控制碳源濃度處于合適的水平使菌體得以生長(zhǎng)良好，發(fā)酵后期補(bǔ)充碳源可為多糖合成提供充足基質(zhì)。根據(jù)前面的初步研究，基本確定30 g/L作為初始葡萄糖濃度，以36 h作為流加補(bǔ)糖的操作時(shí)間點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，研究了3種補(bǔ)料方式對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖合成的影響(表1)。一次性補(bǔ)料工藝:在發(fā)酵進(jìn)行36 h時(shí)，一次性將30 g/L的葡萄糖補(bǔ)加進(jìn)發(fā)酵罐;恒速流加補(bǔ)料工藝:在發(fā)酵進(jìn)行36 h，以0.83 g/(L·h)恒定速度將30 g/L葡萄糖補(bǔ)加進(jìn)發(fā)酵罐，至72 h補(bǔ)加完畢;分批補(bǔ)料工藝:于36、48、60及72 h分批次補(bǔ)加葡萄糖，每次補(bǔ)加葡萄糖量為7.5 g/L。

表1 不同補(bǔ)料方式對(duì)菌體生長(zhǎng)及多糖合成的影響Table 1 Effects of different feeding methods on cell growth and polysaccharide yield

結(jié)果表明，采取分批補(bǔ)糖發(fā)酵方式能達(dá)到最好的效果，而且比恒速流加補(bǔ)料工藝操作簡(jiǎn)便。其發(fā)酵工藝可以概述為:在發(fā)酵初期以30 g/L葡萄糖作為初始碳源，發(fā)酵進(jìn)行36 h開始補(bǔ)料，以后每隔12 h補(bǔ)1次，共補(bǔ)加4次，每次補(bǔ)加7.5 g/L葡萄糖，全部發(fā)酵過(guò)程總葡萄糖濃度為60 g/L。

2.3 5 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵與補(bǔ)料分批發(fā)酵結(jié)果比較

以2.2中確定的補(bǔ)糖策略，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并與分批發(fā)酵結(jié)果相對(duì)比，以此驗(yàn)證2.2中確定的補(bǔ)糖策略的合理性。補(bǔ)料分批發(fā)酵:初始葡萄糖濃度為30 g/L，發(fā)酵進(jìn)行36 h開始補(bǔ)料，之后每隔12 h補(bǔ)1次，共補(bǔ)加4次，每次補(bǔ)加7.5 g/L葡萄糖，全部發(fā)酵過(guò)程總葡萄糖濃度為60 g/L。分批發(fā)酵:初始葡萄糖濃度為60 g/L，發(fā)酵過(guò)程中不進(jìn)行任何形式的葡萄糖補(bǔ)加。發(fā)酵罐其他條件相同，如1.3.1。

比較分批發(fā)酵和補(bǔ)料發(fā)酵的過(guò)程(圖4)，可看出分批發(fā)酵過(guò)程前期菌體生長(zhǎng)較補(bǔ)料分批發(fā)酵慢，發(fā)酵72 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期后，分批發(fā)酵菌體濃度明顯低于補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝，多糖濃度僅為28.22 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為47.0%，轉(zhuǎn)化率較低。究其原因，可能是由于分批發(fā)酵過(guò)程多糖過(guò)早合成并積累，導(dǎo)致發(fā)酵體系中傳氧、傳質(zhì)效果不佳，不利于菌體生長(zhǎng);發(fā)酵進(jìn)行60 h，發(fā)酵體系中仍殘存較高濃度葡萄糖，并且之后葡萄糖利用速度明顯變慢，引起抑制效應(yīng)，進(jìn)一步限制多糖積累。在其他微生物多糖，如結(jié)冷膠的發(fā)酵過(guò)程中也有類似現(xiàn)象［14］。

圖4 發(fā)酵罐中分批發(fā)酵與補(bǔ)料分批發(fā)酵過(guò)程圖Fig.4 Batch and fed-batch fermentation process changes in fermentation

補(bǔ)料分批發(fā)酵前期菌體生長(zhǎng)較快，60 h左右便進(jìn)入穩(wěn)定期，說(shuō)明發(fā)酵前期降低初始葡萄糖濃度有利于菌體生長(zhǎng)。發(fā)酵前期多糖積累較慢，遲滯期約10 h，20 h左右多糖開始積累，較分批發(fā)酵遲。36 h補(bǔ)加葡萄糖后，多糖繼續(xù)大量積累。多糖濃度最終達(dá)到38.62 g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率為64.4%，相對(duì)于分批發(fā)酵提高36.8%。由此可見，補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝對(duì)菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物合成及葡萄糖轉(zhuǎn)化率等均具有促進(jìn)作用，且對(duì)提高多糖產(chǎn)量效果尤為明顯。

3 結(jié)論

本研究在考察Bacillus mucilaginosus SM-01對(duì)葡萄糖利用效率和胞外多糖合成產(chǎn)量的基礎(chǔ)上，通過(guò)比速率分析，確定了合適的初始葡萄糖濃度和補(bǔ)料時(shí)間，進(jìn)而通過(guò)不同補(bǔ)料工藝的對(duì)比研究，確定了分批補(bǔ)料的發(fā)酵策略。在5 L發(fā)酵罐上，通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵，膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖濃度達(dá)到38.62 g/L，相對(duì)分批發(fā)酵提高了36.8%，葡萄糖轉(zhuǎn)化率也由47.0%提高至64.4%。

國(guó)內(nèi)外基于發(fā)酵罐，關(guān)于膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵工藝的報(bào)道還較少，本文對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵工藝進(jìn)行研究并提出一套高產(chǎn)的補(bǔ)料工藝，對(duì)促進(jìn)膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的大規(guī)模應(yīng)用有重要意義。本文以提高膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖發(fā)酵產(chǎn)率及葡萄糖轉(zhuǎn)化率為目標(biāo)，立足于初始葡萄糖濃度、補(bǔ)料時(shí)間及補(bǔ)料方式對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，提出了一種補(bǔ)料分批發(fā)酵的工藝，提高了膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的發(fā)酵產(chǎn)率及葡萄糖轉(zhuǎn)化率。該工藝簡(jiǎn)便，具有較好的工業(yè)可操作性，對(duì)降低膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖的工業(yè)成本、提高產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效益有積極意義。

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