曹雪丹，李二虎，方修貴，趙凱，周偉東

1(浙江省柑桔研究所，浙江臺州，318020)2(華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，環(huán)境食品學教育部重點實驗室，湖北武漢，430070)3(浙江藍美農(nóng)業(yè)有限公司，浙江 諸暨，311812)

藍莓(Blueberry)，為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)多年生落葉或常綠灌木。藍莓果實不僅味道鮮美，而且營養(yǎng)豐富，被譽為“世界漿果之王”。研究發(fā)現(xiàn)，藍莓富含的花色苷具有促進視紅素再合成、抗炎癥、抗癌、延緩衰老、提高免疫力等多種生理活性功能，經(jīng)常食用可明顯增強視力、消除視疲勞、增強心臟功能，而且能延緩腦神經(jīng)衰老，有效預防尿路感染，減少某些癌癥和早性老年癡呆病的患病風險［1－2］。以藍莓作為釀造原料的發(fā)酵酒是一種類似干紅葡萄酒的新興果酒，隨著人們生活水平的提高，藍莓酒不僅保證了釀酒原料的營養(yǎng)價值及保健功能，且更加符合現(xiàn)代人們追求綠色和健康的理念。

頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)是一種快速的樣品分析預處理新技術，可以簡化樣品提取過程，提高分析的速度和靈敏度，因其具有方法簡單、無需試劑、提取效果好、變異系數(shù)小等諸多優(yōu)點，已在環(huán)境、食品、生化、醫(yī)學等領域有所應用［3］。張春雨等［4－5］采用靜態(tài)頂空和氣相色譜-質譜聯(lián)用技術，研究了高叢和半高叢越橘果實香氣成分，分別檢測出67種和39種揮發(fā)性成分。陳雪等［6］采用水蒸氣蒸餾萃取法對3個地區(qū)越橘酒的揮發(fā)性成分進行萃取并分析，共檢測到主要揮發(fā)性物質40種，其中普遍存在的成分有21種。嚴紅光等［7］和蓋禹含等［8］均采用頂空固相微萃取技術研究了3種不同酵母對藍莓酒揮發(fā)性成分的影響，分別檢測出29種和76種香氣成分。

通常果酒的香氣成分是構成和影響果酒質量、典型性的主要因素，也是評價酒品優(yōu)劣的重要指標。一般來說，果酒中的香氣主要來源于果實本身、發(fā)酵及陳釀3方面，而主發(fā)酵階段則是釀酒的關鍵工藝所在。目前對藍莓果實及果酒香氣成分的研究已有所報道，但是對藍莓酒主發(fā)酵前后香氣成分的變化及對比尚不多見，本文采用頂空固相微萃取與氣質聯(lián)用技術，對藍莓果酒主發(fā)酵前后揮發(fā)性物質進行分析，以期為藍莓酒香氣成分研究及品質評價標準提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍莓凍果(南高叢，產(chǎn)自浙江諸暨)，浙江藍美農(nóng)業(yè)有限公司;葡萄酒活性干酵母，安琪酵母股份有限公司;果膠酶(30 U/mg)，合肥博美生物科技有限責任公司;白砂糖等均為市售食品級。

1.2 儀器設備

PAL-3手持式數(shù)字折射儀，日本ATAGO公司;MJ-176NR榨汁/攪拌機，日本松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社;SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司;ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司;HWS-12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司;S22-2恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司;Agilent 7890A氣相色譜儀，美國Agilent公司;Agilent 5975C質譜儀，美國 Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME 萃取頭，美國Supelco公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藍莓酒發(fā)酵工藝流程［9－10］

1.3.2 固相微萃取

準確量取5 mL樣品移入10 mL鉗口樣品瓶中，加入2.00 g NaCl，聚四氟乙烯隔墊密封，在磁力攪拌器上加熱至60℃，平衡30 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭頂空吸附40 min，插入GC進樣口解析5 min進行GC-MS分析。

1.3.3 GC-MS測定

氣相色譜條件:毛細管柱為DB-WAX(30 m×320 μm ×0.25 μm)，程序升溫，起始溫度40 ℃，保持3 min，以3℃/min升至160℃，保持2 min，再以8℃/min升至220℃，保持3 min，進樣口溫度250℃。

質譜條件:MS電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度230℃。

定性分析:應用氣相色譜-質譜聯(lián)用儀進行分析鑒定，并利用C6～C20正構烷烴的保留時間計算各個色譜峰的保留指數(shù)。分析結果運用計算機譜庫(NIST05a)進行初步檢索及資料分析，再結合文獻進行人工譜圖解析確認檢測物成分。

2 結果與討論

2.1 藍莓酒主發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的GC-MS分析

圖1 藍莓酒主發(fā)酵前揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of GC-MS for volatile components in blueberry wine before primary fermentation

藍莓酒主發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的GC-MS分析結果分別見圖1、圖2和表1表2。結果顯示，藍莓酒主發(fā)酵前的揮發(fā)性成分主要由萜類(11種)、醇類(12種)、酯類(8種)和酸類(3種)等共36種成分組成。主發(fā)酵后的揮發(fā)性成分較多，主要由萜類(13種)、酯類(13種)、烴類(8種)、醇類(7種)和酸類(4種)等共46種成分組成。

圖2 藍莓酒主發(fā)酵后揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of GC-MS for volatile components in blueberry wine after primary fermentation

表1 藍莓酒主發(fā)酵前揮發(fā)性成分的GC-MS分析結果Table 1 Analytical results of GC-MS for volatile components in blueberry wine before primary fermentation

續(xù)表1

表2 藍莓酒主發(fā)酵后揮發(fā)性成分的GC-MS分析結果Table 1 Analytical results of GC-MS for volatile components in blueberry wine after primary fermentation

續(xù)表2

2.2 藍莓酒發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的比較分析

由表1、表2可知，藍莓酒主發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的種類和構成變化較大，由36種增加到46種，新增8種烴類化合物，萜類和酯類化合物的種類有所增加，而醇類化合物則有所減少。主發(fā)酵過程是完成藍莓酒由果汁到果酒的主要香氣變化階段，通過對其前后揮發(fā)性組分的變化研究可作為未來工藝改進和工藝控制的基礎依據(jù)。

2.2.1 醇類化合物

在主發(fā)酵階段，醇類物質主要由酵母等微生物作用于糖分、果膠質和氨基酸等轉化產(chǎn)生，也包括亞麻酸降解產(chǎn)物的氧化。通過主發(fā)酵后，新增3種成分，分別為異丁醇、2，7-二甲基-4，5-辛二醇和十三醇;消失了8種成分，分別為葉醇、2-環(huán)戊基乙醇、(S)-2-庚醇、2-乙基-1-己醇、正辛醇、2-(4-甲基苯基)丙-2-醇、6-甲基-2-(2-環(huán)氧乙烷基)-5-庚烯-2-醇和月桂醇。

乙醇是藍莓發(fā)酵酒中除水以外的主要成分，它本身幾乎無味，但會增加酒的刺激感和濃郁度，決定著藍莓果酒的基本口感。其主要來源于藍莓汁中的糖分在無氧條件下由酵母菌代謝分解為乙醇和二氧化碳。在酒精發(fā)酵過程中，乙醇含量增加的同時總伴隨著還原糖含量的下降，一般在前發(fā)酵階段還原糖含量下降速度最快，發(fā)酵3 d以后乙醇含量快速升高，至8d左右還原糖含量的減少趨于緩慢，此時乙醇含量通常處于較高水平。整個主發(fā)酵過程是產(chǎn)生乙醇的關鍵階段。

苯乙醇是一種具有淡雅細膩玫瑰氣味的芳香醇，自然存在于許多植物的精油中，如風信子、茉莉等，它在很低的濃度下就能產(chǎn)生很高的玫瑰香味，是葡萄酒重要的呈香物質之一［11］。在發(fā)酵過程中，一些酵母菌能夠通過莽草酸途徑從頭合成或通過氨基酸分解途徑將L-苯丙氨酸轉化為苯乙醇［12］。不過大多數(shù)酵母從頭合成苯乙醇的濃度都很低，若添加L-苯丙氨酸可以大大提高苯乙醇的含量，且不同酵母發(fā)酵產(chǎn)生苯乙醇的能力也各不相同。

正己醇是一種具有水果清香味的重要呈味物質，在草莓［13］、蘋果［14］、番石榴［15］、梨、杏子和桃［16］果實的揮發(fā)性成分中均檢測含有正己醇，于愛梅等［17］還比較了蘋果濃縮汁及其發(fā)酵酒中的香氣物質，發(fā)現(xiàn)正己醇在發(fā)酵以后含量顯著降低。這可能是因為正己醇在乙酸參與的條件下經(jīng)醇酰基轉移酶(AAT)催化生成乙酸己酯或丁酸己酯，它在脫氫酶(ADH)的還原作用下還可能轉化為己醛［18］。

新出現(xiàn)的醇類化合物主要為異丁醇等高級醇。高級醇又稱雜醇，丙醇以上即可稱為高級醇，苯乙醇、正己醇等雜醇均是果酒香氣的主要構成，含量適當可改善酒體的口感，但是由于人體分解高級醇比乙醇困難得多，所以容易造成麻醉，引起缺氧和頭痛等癥狀［19］。有些酵母可以利用氨基酸中的氨經(jīng)脫羧后生成高級醇，一般蛋白質含量越高，其生成的高級醇也越多。同時，這些高級醇還是一些酯類物質的前體，有利于后期陳釀香的產(chǎn)生。

消失的葉醇和月桂醇分別具有強烈的綠色嫩葉氣味和花香味，它們的消失使藍莓果酒中的生青味明顯降低，生酒味才得以體現(xiàn)。

而且，整個主發(fā)酵階段幾乎沒有檢測出類似甘油等能夠賦予果酒甜味和醇味的多元醇類化合物，這可能是因為發(fā)酵的時間較短，且厭氧條件下也不利于微生物產(chǎn)生多元醇。

2.2.2 酯類化合物

酯類在酒精發(fā)酵過程中是以副產(chǎn)物的形式出現(xiàn)的。酯化反應速度很慢，并且反應到一定程度即行停止，一般是在酯化酶的作用下合成的。酯化酶催化酵母細胞內的活性酸與醇結合形成酯。其中的脂肪酸乙酯類產(chǎn)生于發(fā)酵過程中的酶代謝以及脂肪酸代謝過程中乙酰輔酶-A的降解;乙酸酯類是由乙酰輔酶-A與氨基酸或碳水化合物降解過程中產(chǎn)生的高級醇反應生成。在藍莓酒主發(fā)酵后新增11種酯類，消失6種。

酯類物質是果酒的主體香氣成分，多數(shù)酯類物質都具有令人愉快的香氣。其中乙酸乙酯具有果香味，是葡萄酒香氣的重要構成成分［20］。王家利等［21］對紅樹莓果實發(fā)酵前后的香氣成分變化進行研究，結果只在后發(fā)酵樣品中檢測到乙酸乙酯(1.15%)，在紅樹莓果汁及主發(fā)酵階段均未檢出;嚴紅光等［22］也只在兔眼藍莓發(fā)酵酒中檢測到乙酸乙酯(0.47%)，而其果實中亦未檢出;而張春雨等［5－6］分別在1個半高叢越橘品種‘北藍’和4個高叢越橘品種‘藍樂’、‘澤西’、‘埃利奧特’和‘達柔’果實中檢測到少量乙酸乙酯(0.042～0.265 μg/g)。說明藍莓發(fā)酵酒的乙酸乙酯一部分來源于果實本身，另一部分則來源于發(fā)酵階段。所以除了適當延長陳釀時間以外，還可以通過選擇含乙酸乙酯的藍莓品種作為釀酒原料來提高果酒中乙酸乙酯的含量。

乳酸乙酯和乙酸乙酯一樣具有減弱尖酸味，協(xié)調苦澀味，令酒香醇厚等作用，它們都是反映果酒風味優(yōu)劣的重要物質。而藍莓酒在主發(fā)酵階段已經(jīng)產(chǎn)生微量的乳酸乙酯，說明通過調整主發(fā)酵工藝也可以改變部分陳化產(chǎn)物的含量，改善新酒的不良口感。但是酯類的生成量與發(fā)酵強度密切相關，發(fā)酵一旦停止，酒的香氣就會減弱，所以藍莓酒主發(fā)酵過程中溫度等工藝條件對乙酸乙酯及乳酸乙酯等酯類物質含量的影響尚待進一步研究。

主發(fā)酵產(chǎn)生甲酸異戊酯有特殊的香蕉和李子的香甜氣［23］，為甲酸酯類中香味最濃的一種。凌育趙等［24］在柿子果酒香氣成分的GC-MS分析中發(fā)現(xiàn)甲酸異戊酯相對含量高達7.44%;戰(zhàn)宇等［25］發(fā)現(xiàn)菠蘿、芒果和香蕉的混釀果酒中含有甲酸異戊酯(0.96%)，而在菠蘿單釀果酒中尚未檢出，也有在啤酒［26］和南非特有的 Pinotage 紅酒［27－28］中檢測出甲酸異戊酯，但是在藍莓發(fā)酵酒中測得甲酸異戊酯含量之高尚屬首次。同時還產(chǎn)生了具有甜香、果香及菠蘿蜜氣味的山梨酸乙酯，具有玫瑰花香和橙子果香的辛酸乙酯，以及能夠反映出微弱的水果香、脂肪香、刺激、苦澀等香氣的乳酸乙酯、癸酸乙酯和肉桂酸乙酯等［29］。

2.2.3 酸類化合物

除了少部分揮發(fā)性有機酸來源于藍莓原料，其他酒中大部分有機酸都是發(fā)酵的副產(chǎn)物。在主發(fā)酵前后有機酸種類變化并不明顯，其對藍莓酒發(fā)酵香的貢獻需通過進一步準確定量方可得到結論。

2.3.4 萜類化合物

萜類廣泛存在于漿果類水果中，但能夠稱之為香氣的主要是具有揮發(fā)性的游離型單萜和倍半萜，而且萜類的沸點相對較高，香氣更加沉穩(wěn)。在所檢出的19種萜類化合物中，有6種物質在發(fā)酵后消失，為α-葑烯、二氫香芹酮、脫氫芳樟醇、α，4-二甲基-3-環(huán)己烯-1-乙醛、橙花醇和薄荷醇，有8種物質在發(fā)酵中所產(chǎn)生，為偽檸檬烯、異松油烯、α-紫羅蘭酮、芳樟醇氧化物(II)等。其中芳樟醇屬于鏈狀萜烯醇類［30］，是存在于歐洲越橘(Vaccinium myrtillus)中的重要萜類化合物［31］;而香芹酮及α-松油醇等都屬于單環(huán)單萜類。藍莓酒中的萜類化合物與藍莓的品種密切相關，在高叢越橘的果實發(fā)育過程中萜類是其特征香氣成分之一，而在半高叢越橘中所占比例十分有限［32］。在藍莓發(fā)酵前測得主要的萜類包括有:芳樟醇具有優(yōu)美的花香香氣，α-松油醇具有紫丁香的香氣，橙花醇具有令人愉快的玫瑰和橙花的香氣，香氣較平和，微帶檸檬樣的果香，香葉醇具有溫和香甜的玫瑰花氣息，香茅醇具有優(yōu)雅的類似于玫瑰花的香氣，D-檸烯具有令人愉快的檸檬香氣。

2.3.5 烴類及其他化合物

烴類化合物主要產(chǎn)生于發(fā)酵過程中糖代謝和各級物質的分解，它們是其他物質的代謝中間產(chǎn)物，大多為不飽和烯烴類物質。在所檢出的8種烴類化合物中，除 2，4-己二烯、3-甲基-1-環(huán)己烯、1-甲基-1-環(huán)己烯、(E)-2，3-二甲基-2，4-己二烯和 1-甲基環(huán)庚烯以外其余3種均為具有苯環(huán)結構的芳香烴類，且這8種物質均為發(fā)酵后產(chǎn)生。還有2種其他類化合物，其中苯甲醛是具有苦杏仁味的結構最簡單的芳香醛，也是浸泡青梅酒的特征香氣物質之一［33］，但在發(fā)酵后消失而未被檢出;而2-乙氧基苯酚在其他有關藍莓及藍莓酒的文獻中尚未見報道。

3 結論

采用固相微萃取(SPME)結合氣相色譜-質譜(GC-MS)聯(lián)用技術，分別對藍莓酒主發(fā)酵前、后的揮發(fā)性成分進行測定。結果顯示，藍莓酒主發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的種類和構成變化較大，由36種增至46種，分屬于醇類、酯類、萜類、酸類和烴類，表明主發(fā)酵過程是完成藍莓酒由果汁到果酒的主要香氣變化階段。通過對其前后揮發(fā)性組分的變化研究，以期為藍莓酒香氣成分研究及品質評價標準提供科學依據(jù)。

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