張園園，李田蘭，顏學申，毛春霞，劉珊珊，孟繁軍

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液內科，山東 青島 266003)

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NPM1和FLT3基因突變的正常核型急性髓系白血病病人臨床特征及預后分析

張園園，李田蘭，顏學申，毛春霞，劉珊珊，孟繁軍

(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液內科，山東 青島 266003)

目的 了解正常核型急性髓系白血病(AML)病人核仁磷酸蛋白1(NPM1)、FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)基因突變的發(fā)生頻率，并探討基因突變伴隨的臨床特征及對近期預后的影響。方法 收集94例初治的正常核型AML病人(M3除外)，行NPM1、FLT3基因突變檢測。結果 94例正常核型AML病人，NPM1基因突變陽性率為40.43%；FLT3內部串聯(lián)重復突變(FLT3-ITD)陽性率為28.72%；NPM1并FLT3-ITD基因突變陽性率為14.89%；FLT3點突變(FLT3-TKD)陽性率為7.45%。與無突變組相比，NPM1+/FLT3-組發(fā)病年齡、外周血白細胞和血小板計數(shù)、骨髓原始細胞比例均較高,差異有顯著性(t=2.048～2.072，P<0.05)。NPM1-/FLT3-ITD+組外周血白細胞計數(shù)和骨髓原始細胞比例均較無突變組高(t=2.549、2.784，P<0.05)。NPM1+/FLT3-組1療程化療誘導完全緩解率為87.50%,高于無突變組的63.89%(χ2=4.205，P<0.05)；NPM1-/FLT3-ITD+組完全緩解率為53.85%，與無突變組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論 NPM1、FLT3基因突變是正常核型AML 病人中常見的分子學異常，此兩種基因突變檢測對AML 病人的個體化治療及預后評估有重要意義。

白血病,髓樣；核型分析；NPM1基因；FLT3基因；突變

核仁磷酸蛋白1(NPM1)及FMS樣酪氨酸激酶3(FLT3)基因突變?yōu)榧毙运柘蛋籽?AML)最常見的基因突變類型，也是目前國內外公認的影響AML病人預后的重要因素之一，尤其對于正常核型AML病人。NPM1基因位于染色體5q35的12外顯子上，編碼產(chǎn)物是一種定位在核仁的核質穿梭

蛋白，可調節(jié)ARF-p53腫瘤抑制途徑。NPM1基因突變的病人多伴有骨髓白血病細胞比例、外周血白細胞(WBC)及血小板(PLT)計數(shù)高等特點，預后相對良好[1]。FLT3基因定位于13q12, 其編碼產(chǎn)物影響著造血祖細胞的正常增殖和分化。FLT3基因突變主要表現(xiàn)為兩種形式：FLT3內部串聯(lián)重復突變(FLT3-ITD)和點突變(FLT3-TKD)。FLT3-ITD基因突變的病人臨床預后較差；但FLT3-TKD基因突變對AML預后的影響尚不明確，目前研究結果傾向于FLT3-TKD基因突變病人預后不良[2]。NPM1與FLT3基因突變常同時存在，并相互作用，共同影響病人的預后[3]。本文回顧性分析94例初治正常核型AML病人的臨床資料，旨在進一步探討NPM1、FLT3基因突變在此類病人中的發(fā)生頻率、伴隨的臨床特征及對近期預后的影響。

1 資料和方法

1.1研究對象

收集我院黃島分院和青島市中心醫(yī)院血液科2011年5月—2014年2月收治的初治正常核型AML病人(M3除外)共94例，男53例，女41例；年齡15～78歲，中位年齡43歲。病人均經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學、流式免疫分型、細胞遺傳學、分子生物學檢查明確診斷。診斷標準參照張之南主編的第3版《血液病診斷及療效標準》。按FAB分型，M0者1例，M1者5例，M2者35例，M4者27例，M5者23例，M6者3例。

1.2基本信息采集

采集病人初診時年齡，性別，外周血WBC、血紅蛋白(HB)、PLT水平，骨髓原始細胞比例，血清乳酸脫氫酶水平等基本信息。

1.3常規(guī)細胞遺傳學分析

取病人髂后上嵴骨髓3～5 mL，肝素鈉抗凝，短期培養(yǎng)法培養(yǎng)24 h,采用G+R顯帶技術進行核型分析。染色體核型描述依據(jù)《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2009)》。

1.4NPM1、FLT3基因突變檢測

所收集的94例病人均于艾迪康醫(yī)學檢驗中心行NPM1、FLT3基因突變檢測。

1.5治療方案及療效判定

所有病人均采用IA方案(IDA 8～12 mg·m-2·d-1，共3 d,Ara-C 100～200 mg·m-2·d-1，共7 d)進行誘導緩解治療。完成1療程后，參照張之南主編的第3版《血液病診斷及療效標準》判定病人是否緩解。

1.6統(tǒng)計學處理

應用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布計量資料用中位數(shù)表示，經(jīng)數(shù)據(jù)轉換后行組間t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗。

2 結 果

2.1NPM1和FLT3基因突變發(fā)生率

本文94例病人中，NPM1基因突變38例，陽性

率為40.43%；FLT3-ITD基因突變27例，陽性率為28.72%；NPM1并FLT3-ITD基因突變14例，陽性率為14.89%；FLT3-TKD基因突變7例，陽性率為7.45%。NPM1和FLT3-ITD基因突變在各亞型中的分布及發(fā)生率見表1。在M1、M2、M4、M5、M6病人中均檢測到NPM1基因突變，以M2、M4病人多見。在M1、M2、M4、M5病人中均檢測到FLT3-ITD基因突變，以M2、M4病人多見；在M2、M4、M5病人中檢測到FLT3-TKD基因突變，均較少見。38例NPM1+病人中14例存在FLT3-ITD基因突變，陽性率為36.84%；56例NPM1-病人中13例(23.21%)存在FLT3-ITD基因突變，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 NPM1和FLT3基因突變在AML各亞型中的分布及發(fā)生率(例(χ/%))

2.2NPM1和FLT3基因突變與臨床特征的關系

2.2.1年齡、性別 NPM1+/FLT3-組與無突變組相比，年齡明顯增大(t=2.052，P<0.05)，其余各組年齡差異無顯著性(P>0.05)。各組性別比較，差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.2.2血WBC、PLT NPM1+/FLT3-組病人外周血WBC及PLT計數(shù)均較無突變組高(t=2.070、2.048，P<0.05)。NPM1-/FLT3-ITD+組病人外周血WBC計數(shù)比無突變組高(t=2.549，P<0.05)。NPM1+/FLT3-ITD+組與無突變組相比，WBC計數(shù)差異有顯著性(t=3.059，P<0.05)。FLT3-TKD+組例數(shù)少，未進行統(tǒng)計分析。見表2。

2.2.3骨髓原始細胞所占比例 NPM1+/FLT3-、NPM1-/FLT3-ITD+、NPM1+/FLT3-ITD+3組初診時骨髓原始細胞比例均顯著高于無突變組(t=2.072～2.784，P<0.05)，F(xiàn)LT3-TKD+組與無突變組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.2.4HB及乳酸脫氫酶 各組HB及乳酸脫氫酶比較差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。

2.3NPM1和FLT3基因突變與預后的關系

NPM1+組完全緩解(CR)率為81.58%(31/38),NPM1-組CR率為60.71%(34/56)，兩組CR率比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.620，P<0.05)。FLT3-ITD+組病人的CR率為62.96%(17/27)，F(xiàn)LT3-ITD-組CR率為71.64%(48/67)，兩組比較差異無顯著性(P>0.05)。NPM1+/FLT3-組CR率與無突變組相比，差異有顯著性(χ2=4.205，P<0.05)；NPM1+/FLT3-ITD+、NPM1-/FLT3-ITD+組與無突變組相比，差異無顯著性。見表2。

表2 NPM1和FLT3基因突變與AML臨床特征及預后的關系

3 討 論

本研究收集了94例正常核型AML病人，對其NPM1、FIT3基因突變進行了檢測，研究結果顯示，NPM1基因突變的陽性率為40.43%，略低于國外的研究結果(45%～64%)[4]，與國內及亞洲國家的研究結果一致(22.4%～47.6%)[2,5-7]。FIT3-ITD基因突變的陽性率為28.72%，高于CHAUHAN等[8]的研究結果(20%)，與國內應逸等[7]的研究結果(26.6%)相近。結果的不同可能是因為本研究統(tǒng)計樣本數(shù)少，或者種族及地區(qū)間差異所致，也不能排除檢測方法造成的差異。本文中NPM1基因突變好發(fā)于M2、M4病人(并且M4病人較M2病人更為常見)，這與FALINI等[3]報道的以M4、M5發(fā)生比例最高的研究結果不同，需擴大樣本進一步驗證。本文中FIT3-ITD基因突變也以M2、M4病人多見。THIEDE等[9]卻認為FIT3-ITD基因突變好發(fā)于M5，少見于M2，這或許與其研究對象沒有限定為正常核型的AML病人有關。

本文結果顯示，NPM1+/FLT3-組年齡較無突變組大，與國內外大部分研究結果一致[6,10]。但有研究顯示，并不是年齡大，NPM1基因突變率就高，更有人認為年齡大于65歲的病人NPM1基因突變率逐漸降低[11-12]。另有研究顯示，性別比在NPM1基因突變組與NPM1基因未突變組間差異無顯著意義[11]。本文研究結果也顯示，各組性別比較差異均無顯著性。

NPM1基因突變的AML病人一般初診時骨髓原始細胞比例、外周血WBC和PLT計數(shù)、乳酸脫氫酶水平高[4]；而FLT3-ITD基因突變的AML病人在初診時外周血WBC計數(shù)、骨髓原始細胞比例顯著高于無突變AML病人，且易發(fā)生高白細胞血癥(>100×109/L)[13]，這與FLT3-ITD基因可以組成性激活其編碼產(chǎn)物——FLT3蛋白，后者可以造成白血病細胞異常增殖、分化受抑及凋亡受阻有關。本文結果顯示，單純NPM1(NPM1+/FLT3-)及單純FIT3-ITD(NPM1-/FLT3-ITD+)基因突變病人，初診時外周血WBC計數(shù)及骨髓原始細胞比例均較無突變病人增高，這在同時并存NPM1、FIT3-ITD基因突變的病人中表現(xiàn)得更為明顯。另外，單純NPM1基因突變病人往往PLT計數(shù)較高，而單純FIT3-ITD基因突變病人則沒有這一特點，這或許與NPM1基因突變后可增強巨核細胞的分化能力有關[14]。本研究未發(fā)現(xiàn)HB、乳酸脫氫酶水平與此兩種基因突變相關。

本研究顯示，AML病人有NPM1、FIT3-ITD基因突變并存現(xiàn)象。同時存在這兩種基因突變的病人往往具有初診時外周血WBC計數(shù)高，1療程的誘導緩解率低，臨床預后差的特點。研究表明，在任何類型AML中均可檢測到FIT3-TKD基因突變，尤其是正常核型及復雜核型病人；FIT3-TKD基因突變易與NPM1基因突變并發(fā)，與FIT3-ITD基因突變并發(fā)極其少見，其臨床意義頗具爭議。本研究中，F(xiàn)IT3-TKD基因突變陽性率為7.45%，明顯低于國外研究結果(11%～14%)[4]，由于病例數(shù)較少，未進行統(tǒng)計學分析。

研究表明，1療程誘導能否獲得CR是影響病人長期生存的重要因素。目前，由于新化療藥物去甲氧柔紅霉素的應用，AML病人1療程的CR率明顯提升。本研究中病人均應用了此藥物誘導治療。在誘導治療后，69.15%的病人獲得了CR,與未檢測到NPM1和FLT3基因突變病人的CR率相近；NPM1+/FLT3-組病人CR率最高(87.50%)，明顯高于無突變組；NPM1-/FLT3-ITD+組CR率最低(53.85%)，但與無突變組比較差異無顯著性。若不考慮基因突變并存因素，NPM1+組病人CR率仍明顯高于NPM1-組。SCHNEIDER等[12]對690例正常核型AML的研究顯示，NPM1基因突變病人1療程誘導化療后，CR率明顯高于NPM1基因突變陰性的病人(75%與57%)，并且這一結果不受是否存在FLT3-ITD基因突變的影響，多變量分析顯示NPM1基因突變是正常核型AML達到緩解的獨立影響因素。PARK等[2]的研究也顯示，在Cox回歸分析模型中，對于NPM1基因突變病人而言，F(xiàn)LT3-ITD基因是否突變不是影響預后的因素，但NPM1并FLT3-TKD基因突變的正常核型AML病人預后較差。由于樣本量太少，本研究沒有進行Logistic回歸分析。THIEDE等[1]研究NPM1基因預后良好的原因認為，NPM1基因野生型可保護造血細胞免受p53誘導凋亡，而白細胞NPM1基因發(fā)生突變后失去了這種保護作用，對化療藥物非常敏感。

FLT3-ITD已被公認為預后不良基因，但本文研究結果顯示，F(xiàn)LT3-ITD+組與FLT3-ITD-組1療程誘導緩解率差異無顯著性，國外CHAUHAN等[8]也得出同樣的結論。或許對于有該基因突變的病人，F(xiàn)LT3-ITD基因突變并不是預后差的惟一因素，可能還有其他因素與其共同作用而影響預后。基因突變水平高的病人預后往往更差。但FLT3-ITD基因穩(wěn)定性差，在疾病發(fā)展過程中易丟失，這為其進一步深入研究增加了困難。

隨著醫(yī)學科學的發(fā)展及分子生物學的應用，越來越多的分子水平的改變被發(fā)現(xiàn)，這些改變參與了急性白血病的發(fā)生發(fā)展，影響著預后。這些分子改變除基因突變外(如上述的NPM1、FLT3基因)，還有些基因過表達[15]。隨著這些分子改變逐漸被發(fā)現(xiàn)，相信對于白血病的預后分層會越來越細，治療會越來越有針對性。

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(本文編輯 馬偉平)

NPM1 AND FLT3 MUTATIONS IN PATIENTS WITH NORMAL KARYOTYPE ACUTE MYELOID LEUKEMIA: CLINICAL CHARACTERISTICS AND PROGNOSIS

ZHANGYuanyuan,LITianlan,YANXueshen,MAOChunxia,LIUShanshan,MENGFanjun

(Department of Hematology, The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the frequency of nucleophosmin (NPM1) and FMS-like tyrosine kinase-3 (FLT3) mutation and its effect on clinical features and short-term prognosis in patients with normal karyotype acute myeloid leukemia (AML).MethodsNinety-four patients who received initial treatment for normal karyotype AML (M3 was excluded) were recruited, and NPM1 and FLT3 mutation detected.ResultsIn 94 normal karyotype AML patients, the mutation rate of NPM1 gene was 40.43%, that of FLT3-ITD gene was 28.72%, coexist FLT3-ITD and NPM1 mutation was 14.89%, and FLT3-TKD mutation rate was 7.45%. Compared with no-mutation group, the age of onset in patients in NPM1+/FLT3-group was older, the white blood cells, platelet counts and percentage of bone marrow blasts in peripheral blood were higher (t=2.048-2.072,P<0.05). The patients in NPM1-/FLT3-ITD+group had higher white blood cell counts and percentage of bone marrow blasts than that in the no-mutation group (t=2.549,2.784;P<0.05). After one course of chemotherapy-induced treatment, the complete remission rate was 87.50% in NPM1+/FLT3-group versus 63.89% in no-mutation group, the difference was significant (χ2=4.205,P<0.05), and the complete remission rate in NPM1-/FLT3-ITD+group was 53.85%, no statistical difference was found as compared with no-mutation group (P>0.05).ConclusionNPM1 and FLT3 gene mutation are common in AML patients with normal karyotype, the detection of these two gene mutations is of important significance for individualized therapy and prognostic assessment of the disease.

leukemia, myeloid; karyotyping; NPM1 gene; FLT3 gene; mutation

2014-06-22;

2015-02-14

張園園(1987-)，女，碩士研究生。

孟繁軍(1962-)，男，碩士，副教授，碩士生導師。

R733.71

A

1008-0341(2015)03-0266-04