路偉，馮震，閻超

(青島大學附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003)

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siRNA聯(lián)合預(yù)照射對肺癌細胞survivin基因表達影響

路偉，馮震，閻超

(青島大學附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003)

目的 探討小干擾RNA(siRNA)聯(lián)合預(yù)照射對肺癌細胞survivin基因表達的影響。方法 在肺癌A549細胞中轉(zhuǎn)染survivin基因的siRNA，分別用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western Blotting方法檢測survivin基因mRNA和蛋白的表達。將肺癌A549細胞分為單純放射組、單純轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染+放射組，采用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，采用細胞集落形成實驗檢測細胞增殖情況，采用CCK8測細胞生長曲線。結(jié)果 siRNA能抑制肺癌細胞survivin基因mRNA和蛋白的表達。siRNA聯(lián)合預(yù)照射較單純轉(zhuǎn)染和單純放射能顯著增加細胞凋亡率，降低細胞的集落形成，抑制細胞生長。結(jié)論 預(yù)照射可以增強siRNA對肺癌細胞survivin基因的抑制作用。

肺腫瘤；RNA干擾；survivin基因；放射療法

無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤之首。survivin基因是一種凋亡抑制基因，高表達于各種惡性腫瘤中。survivin蛋白具有抑制細胞凋亡、參與細胞周期調(diào)控、促進細胞增殖和有絲分裂、促進血管增生等生物學功能，是腫瘤診斷和治療的理想靶點之一。新開發(fā)的RNA干擾技術(shù)可以快速、有效地沉默靶基因的表達，已成為基因治療的研究熱點。該方法特異性強、抑制率高，已在實驗研究、抗腫瘤基因治療等方面得到廣泛應(yīng)用。本研究擬將RNA干擾技術(shù)用于survivin基因靶向治療，并與放射治療結(jié)合增強其轉(zhuǎn)導(dǎo)率, 沉默肺癌細胞survivin基因的表達，消除其高表達引起的放化療抗拒?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1主要材料

人肺鱗狀細胞癌A549細胞株由上?？谇会t(yī)學重點實驗室提供。DMEM購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購自Gibco公司；cDNA合成試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(Takara)購自大連寶生物工程有限公司；Trizol及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司；硝酸纖維素膜(Qiagen)、BCA蛋白濃度測定液(Pierce)及蛋白Marker(Fermentas)購自碧云天公司；β-Actin抗體和survivin抗體(Abcam)均為單克隆抗體，購自上海優(yōu)寧維生物公司；survivin小干擾RNA(siRNA)(Biomics)購自上海艾雙生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 肺癌A549細胞使用含有體積分數(shù)為0.10 FBS、105U/L青霉素和105U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、體積分數(shù)0.05的CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)。

1.2.2survivin蛋白的Western Blotting檢測 將肺癌A549細胞分為空白組(A549組)、陰性對照組(NC組)、siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組。取各組對數(shù)生長期細胞，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次后用

蛋白裂解液于冰上裂解20 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，上清液用BCA法測定蛋白濃度，將上樣蛋白加入SDS凝膠加樣緩沖液中，100 ℃加熱5 min使蛋白變性。將處理后的樣品加入SDS-PAGE凝膠中電泳分離，電壓60 V電泳30 min使染料進入分離膠，將電壓加至130 V電泳80 min，然后將蛋白質(zhì)從凝膠電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，于200 mA下轉(zhuǎn)膜1 h，將膜放入封閉液中孵育2 h，TBST洗滌3次；加入survivin抗體4 ℃搖床上孵育過夜，TBST洗滌3次，加兔二抗于室溫孵育1 h，TBST洗滌3次；加入顯色液后掃膜，以β-Actin蛋白表達作為對照。

1.2.3survivin mRNA的RT-PCR檢測 應(yīng)用Trizol試劑從細胞中提取總RNA并測定濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用實時熒光定量PCR法檢測survivin mRNA表達。逆轉(zhuǎn)錄條件:42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。反應(yīng)終止后置冰上冷卻，于-20 ℃保存。PCR擴增條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。重復(fù)檢測3次，每次做3個復(fù)孔，分別計算同一樣品3個復(fù)孔的ct值，以β-actin 作為內(nèi)參照，分別計算上述各組2-△△ct，用以表示目的基因的相對表達量。

1.2.4脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染 將A549細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板，生長至90%～95%融合時棄培養(yǎng)液，采用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamin 2000進行siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染4～6 h后，更換為含體積分數(shù)0.10 FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每種siRNA轉(zhuǎn)染重復(fù)3次。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 將細胞分為空白組(A組)、陰性對照組(B組)、轉(zhuǎn)染組(C組，轉(zhuǎn)染采用siRNA1序列)，分別采用0、5、10 Gy照射劑量處理各組細胞，照射24 h后檢測各組細胞凋亡率。然后單獨采用5 Gy照射劑量處理上述3組細胞，于照射0、6、12、24 h檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率檢測具體步驟：將對數(shù)生長期的肺癌細胞制成細胞懸液，離心棄上清液，PBS重懸，顯微鏡下計數(shù)，離心5 min，加入1×Binding Buffer 400 μL重懸，加入Annexin V 5 μL混勻，避光室溫孵育15 min，加入PI染色液10 μL，混勻，冰上避光孵育30 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.6平板克隆形成實驗 將細胞分為單純轉(zhuǎn)染組、單純放射組、轉(zhuǎn)染+放射組。給予相應(yīng)處理，放射劑量均為5 Gy。取各組對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，梯度稀釋后接種于直徑為10 cm的培養(yǎng)皿(每皿103個細胞)中，待細胞貼壁后予以放射線外照射，繼續(xù)培養(yǎng)2周，觀察細胞生長情況。棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次， 用40 g/L多聚甲醛5 mL固定細胞1 h，去固定液，加適量GIMSA染色液染30 min，流水緩慢洗去染色液，將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，在低倍顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的克隆數(shù)并計算克隆形成率。克隆形成率 =(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。每組細胞實驗重復(fù)4次。

1.2.7CCK8法測定細胞生長曲線 細胞分組同1.2.6。各組每孔分別接種3×103個細胞于96孔細胞培養(yǎng)板中，用DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后棄培養(yǎng)液，每孔再加入CCK8至終質(zhì)量濃度5 g/L，待藍紫色結(jié)晶顆粒充分溶解后于570 nm處測吸光度值，每組設(shè)6個復(fù)孔，連續(xù)7 d，實驗重復(fù)3次。然后以吸光度值為縱軸，時間為橫軸繪制細胞生長曲線。

1.3統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1肺癌細胞survivin mRNA及蛋白的表達

siRNA1組、siRNA2組survivin mRNA表達水平與A549組比較，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.93、11.46，P<0.05)；NC組、siRNA3組與A549組比較，差異無顯著性(P>0.05)。見圖1。siRNA1組和siRNA2組 survivin蛋白的表達較NC組和A549組明顯減弱。見圖2。

2.2放射對survivin siRNA 轉(zhuǎn)染肺癌細胞凋亡的影響

受到5、10 Gy劑量照射后，3組細胞的凋亡率均較0 Gy有不同程度增加，而且照射劑量越大細胞凋亡率越高。細胞凋亡率與照射劑量和轉(zhuǎn)染均有關(guān)(F=200.15、232.35，P<0.01),且二者間有交互作用(F=270.34，P<0.01)。見表1。隨著照射后時間的延長，各組細胞凋亡率均呈上升趨勢；同一時間不同組間比較，轉(zhuǎn)染組的細胞凋亡率增高明顯。細胞凋亡率與照射時間和轉(zhuǎn)染均有關(guān)(F=494.08、163.11，P<0.01)，而且二者間有交互作用(F=134.17，P<0.01)。見表2。

圖1 不同處理組survivin mRNA的表達

圖2 不同處理組survivin蛋白的表達

表1 不同劑量照射各組肺癌細胞凋亡率比較

表2 各組5 Gy照射后不同時間肺癌細胞凋亡率比較

2.3放射對survivin siRNA轉(zhuǎn)染肺癌細胞增殖能力的影響

單純轉(zhuǎn)染組細胞克隆形成率為(44.4±4.73)%(n=4)，單純放射組為(41.3±2.53)%(n=4)，而轉(zhuǎn)染+放射組為(28.1±2.13)%(n=4)，單純轉(zhuǎn)染組的克隆形成率高于其他兩組(F=26.97,P<0.01)。

2.4放射對survivin siRNA轉(zhuǎn)染肺癌細胞生長能力的影響

單純轉(zhuǎn)染組吸光度為1.86±0.04(n=6)，單純放射組為0.89±0.01(n=6)，轉(zhuǎn)染+放射組為0.62±0.03(n=6)，單純轉(zhuǎn)染組的吸光度高于其他兩組(F=50.32，P<0.01)。各組肺癌細胞生長曲線見圖3。

3 討 論

肺癌是當今世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，約50%的肺癌臨床診斷時已屬晚期，因此迫切需要尋找新的診斷指標和治療方法[1]?，F(xiàn)代分子生物學研究證明，肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多階段、多步驟的復(fù)雜演進過程。survivin基因是目前發(fā)現(xiàn)的最強凋亡抑制因子，其編碼的蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成員，該蛋白高表達于人類大多數(shù)惡性腫瘤細胞中，而在正常組織中呈低表達或不表達。目前研究已證實，survivin基因在細胞周期、細胞凋亡及腫瘤血管形成中均發(fā)揮著重要作用。相關(guān)研究報道，survivin基因在非小細胞肺癌中的表達率可高達96%[2-3]。本研究也進一步證實了survivin基因在肺鱗癌細胞株中的陽性表達。本實驗采用脂質(zhì)體直接轉(zhuǎn)染的瞬時轉(zhuǎn)染方式，但體外通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染siRNA的轉(zhuǎn)染率并不高，故有些學者采用預(yù)照射的方式來提高轉(zhuǎn)染率。曾亮等[4]的研究結(jié)果表明，采用3 Gy的低劑量照射可使腺病毒載體Ad5-CMVlacZ介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率明顯提高，同時使腺病毒基因與細胞基因組之間的整合率明顯提高，細胞內(nèi)lacZ基因表達時間也從20 d延長到50 d[4]。TANG等[5]研究顯示，小鼠肺癌細胞受到2～40 Gy的γ線照射后，再感染AdCMVluc,可以導(dǎo)致細胞內(nèi)luc基因編碼產(chǎn)物呈劑量依賴性擴增，擴增率可達24倍，可以有效抑制腫瘤的生長。LEE等[6]用9 Gy的γ線照射成纖維細胞后，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移率較對照組提高1 400倍。SONG等[7]采用siRNA阻抑存活素在Hela細胞中的表達，可以有效提高細胞的放射敏感性。

圖3 各組肺癌細胞生長曲線

本實驗設(shè)計了3條survivin基因的干擾序列，結(jié)果證實，siRNA1和siRNA2兩條序列的干擾作用最為明顯，故在檢測survivin的表達情況時選擇了這兩條序列進行實驗。在后續(xù)的實驗中因分組較多，轉(zhuǎn)染組只選用了siRNA1序列。本文結(jié)果顯示，siRNA能夠從mRNA和蛋白水平抑制肺癌A549細胞survivin基因的表達，siRNA通過阻斷survivin基因的表達可以明顯促進細胞的凋亡，該結(jié)果與曾亮等[8]的研究相一致。但轉(zhuǎn)染組與陰性對照組相比，差異無顯著意義。綜合相關(guān)文獻[9-10]，本實驗使用0、5、10 Gy的X射線照射細胞。本文結(jié)果顯示，預(yù)照射聯(lián)合siRNA較單純siRNA能明顯提高細胞凋亡率，預(yù)照射可以增強siRNA對細胞凋亡的影響。說明預(yù)照射可增強siRNA抑制細胞增殖的能力，預(yù)照射聯(lián)合siRNA能顯著抑制細胞的生長。

本研究創(chuàng)新性地將基因靶向治療和放療結(jié)合，這種治療具有雙重靶向作用，可能提高腫瘤局部藥物濃度和轉(zhuǎn)染效果，從而增加放化療敏感性。本研究結(jié)果可以為轉(zhuǎn)基因治療進入臨床提供理論基礎(chǔ)，同時，也必將為肺癌及其他腫瘤的治療提供一種新的思路和方法。

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(本文編輯 馬偉平)

EFFECTS OF COMBINED PRE-IRRADIATION WITH SIRNA ON THE EXPRESSION OF SURVIVIN GENE IN LUNG CANCER

LUWei,FENGZhen,YANChao

(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the effects of combined siRNA with irradiation on expression of survivin gene in lung cancer cells.MethodsThe siRNA of survivin gene was transfected to A549 cells of lung cancer, the expressions of survivin gene RNA and protein levels in lung cancer cells were detected using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blotting. The A549 lung cancer cells were divided into three groups as: radiation group, siRNA transfection group and transfection plus radiation group, using flow cytometry to detect cell apoptosis rate, cell colony forming experiment to test cell proliferation, and CCK8 to determine the cell growth curves.ResultsSurvivin siRNA could inhibit the expression of survivin RNA and protein. Combined siRNA with pre-irradiation increased the apoptosis versus irradiation alone, decreased cell colony formation, and inhibited the growth of cells, the differences were statistically significant.ConclusionPre-irradiation can enhance inhibition of survivin siRNA on lung cancer cells.

lung neoplasms; RNA interference; survivin gene; radiotherapy

2014-07-08;

2015-01-26

路偉(1987-)，女，碩士。

閻超(1971-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。

R734.205

A

1008-0341(2015)03-0256-04