閆朝春

(連云港市東方醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 連云港222042)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)由于靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單且不需要特別昂貴的儀器設(shè)備而被臨床實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用[1，2]，目前梅毒螺旋體特異性抗體 (Treponema pallidum specific antibody,TPAb)的檢測(cè)大多就采用此方法。ELISA法是一種固相載體包被的免疫標(biāo)記檢驗(yàn)技術(shù)，其本身存在諸多影響因素，如標(biāo)本處理、試劑盒選擇、溫育條件、洗板方式等等[3，4]，一旦哪一步操作不好，結(jié)果就有可能產(chǎn)生偏差。本文就ELISA法檢測(cè)TP-Ab試驗(yàn)中的洗液對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行了一番探討，旨在尋找最佳的洗滌方式，以便規(guī)范試驗(yàn)操作,提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本的選擇 選取TP-Ab陽(yáng)性標(biāo)本68例(OD>1.000)，陰性標(biāo)本 24 例(OD<0.010)，標(biāo)本均無(wú)溶血和脂血。

1.2 試劑與儀器 試劑為北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒(酶聯(lián)免疫法)，批號(hào)為 N20140203，有效期為 2015-01；儀器為Addcare ELISA 600型酶免分析工作站，由煙臺(tái)艾德康生物科技有限公司提供；質(zhì)控品購(gòu)自江蘇省臨床檢驗(yàn)中心，規(guī)格為12mIU(2NCU)/ml，批號(hào)為201311003。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 將選取的臨床陽(yáng)性標(biāo)本用混合血清(OD小于0.005)稀釋至S/CO于0.8~1.3范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，分別用蒸餾水、純凈水和自來(lái)水配制三種洗液，以平行試驗(yàn)改變?nèi)N洗液對(duì)92例樣本(陰性24例，弱陽(yáng)性42例，強(qiáng)陽(yáng)性26例)進(jìn)行平行試驗(yàn)。并以蒸餾水將洗液配制成不同濃度(濃度1：1:5，濃度 2：1:20，濃度 3：1:40，濃度 4：1:80)對(duì) 92 例樣本(陰性24例，弱陽(yáng)性42例，強(qiáng)陽(yáng)性26例)進(jìn)行試驗(yàn)。洗板過(guò)程中注液體積為350μl,均浸泡30s。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理 結(jié)果在Stata 9.2統(tǒng)計(jì)軟件包上進(jìn)行處理，計(jì)量資料均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同水質(zhì)的洗液對(duì)ELISA法檢測(cè)TP-Ab結(jié)果的影響 純凈水組與蒸餾水組弱陽(yáng)性標(biāo)本的S/CO值比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，自來(lái)水組弱陽(yáng)性標(biāo)本的S/CO值高于蒸餾水組(P<0.05)，詳見(jiàn)表1；自來(lái)水組的陽(yáng)性率分別高于蒸餾水組和純凈水組(P<0.05)，而純凈水組與蒸餾水組檢測(cè)陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，詳見(jiàn)表 2。

2.2 以蒸餾水配制不同濃度的洗液對(duì)ELISA法檢測(cè)TP-Ab結(jié)果的影響 高濃度的洗液造成試驗(yàn)結(jié)果OD值偏低，陽(yáng)性率降低；低濃度的洗液則使OD值升高，陽(yáng)性率升高。結(jié)果詳見(jiàn)表3和表4。

2.3 不同洗液對(duì)ELISA法檢測(cè)梯度濃度TP-Ab質(zhì)控結(jié)果的影響 自來(lái)水配制的洗液結(jié)果高于蒸餾水，蒸餾水配制的洗液以1:20為標(biāo)準(zhǔn)，濃度越高，OD值偏低，濃度越低，OD值偏高。結(jié)果詳見(jiàn)表5。

表1 不同水質(zhì)的洗液對(duì)ELISA法檢測(cè)TP-Ab的OD值變化結(jié)果

表2 不同水質(zhì)的洗液對(duì)ELISA法檢測(cè)TP-Ab的結(jié)果陽(yáng)性率

表3 不同濃度的洗液ELISA法檢測(cè)TP-Ab的OD值變化結(jié)果

表4 不同濃度的洗液ELISA法檢測(cè)TP-Ab的結(jié)果陽(yáng)性率

表5 不同洗液對(duì)ELISA法檢測(cè)梯度濃度TP-Ab質(zhì)控結(jié)果(OD值)分析

3 討論

ELISA法操作簡(jiǎn)單，靈敏度和特異性高，但影響因素也較多，如加樣量、洗板和溫度等等[5]。該方法為非均相免疫測(cè)定技術(shù),需要洗去非特異性結(jié)合或過(guò)量的抗原抗體反應(yīng)物,從而保證檢測(cè)結(jié)果的特異性[6],所以洗板也是其關(guān)鍵的一步，尤其是洗液的正確配制直接關(guān)系到洗板的質(zhì)量。

TP-Ab ELISA法檢測(cè)一般采用雙抗原夾心法，原理是將抗原預(yù)先包被在固相載體表面，其后按不同的步驟分別加入待檢抗體和酶標(biāo)抗原，充分反應(yīng)后經(jīng)適當(dāng)?shù)南礈?，使未與固相載體上包被的抗原結(jié)合的抗原抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)合物完全洗去，待加入相應(yīng)的底物后通過(guò)酶對(duì)底物的催化顯色程度來(lái)對(duì)標(biāo)本中的抗體進(jìn)行定性或定量[2，7]。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，洗滌起了重要作用，如果洗滌不充分(次數(shù)不夠或洗滌不干凈)，殘留在微孔板上的酶標(biāo)抗體中的酶會(huì)使后來(lái)加的無(wú)色底物液變成有色產(chǎn)物，產(chǎn)生了非特異性顯色反應(yīng)，出現(xiàn)假陽(yáng)性的結(jié)果[8，9]，并且洗滌次數(shù)越少越容易造成假陽(yáng)性，尤其值得注意的是，試劑盒洗液的配制是由試劑廠家反復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證的，人為改變洗液配制的水質(zhì)及比例容易影響洗滌效果，使一些非特異性結(jié)合物沒(méi)有洗掉而造成假陽(yáng)性；也可能造成固相結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物脫離，使檢測(cè)吸光度值降低造成假陰性[7]。本實(shí)驗(yàn)佐證了用自來(lái)水配制洗滌液比用蒸餾水配制的容易造成假陽(yáng)性結(jié)果(P<0.05)，而純凈水與蒸餾水無(wú)明顯差異(P>0.05)。原因也許就是謝毅[10]認(rèn)為的在一定范圍內(nèi)洗液離子強(qiáng)度高低與非特異性反應(yīng)的出現(xiàn)呈負(fù)相關(guān)而影響檢測(cè)結(jié)果。所以,洗液成分[4]改變會(huì)造成與固相結(jié)合的抗原／抗體脫離的程度不同，從而影響檢測(cè)的靈敏度，使樣本檢測(cè)的OD值改變[11]。本實(shí)驗(yàn)中用蒸餾水配制不同濃度的洗液檢測(cè)結(jié)果是高濃度的洗液造成OD值偏低，陽(yáng)性率降低；低濃度的洗液則使OD值升高，陽(yáng)性率升高，也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。也有部分實(shí)驗(yàn)室用自來(lái)水配制洗液，更有甚者直接以自來(lái)水代替洗液，此種做法都很危險(xiǎn),應(yīng)引起大家足夠的重視[12-15]。

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