葛熙 ，洪煜婧，趙枰

(1、南通大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，江蘇 南通226001；2、南通大學公共衛(wèi)生學院預防醫(yī)學141班，江蘇 南通226019)

慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia，CML)是一起源于造血干細胞的血液系統(tǒng)惡性疾病。臨床上分為慢性期、加速期和急變期，臨床上急性變是引起患者死亡的主要原因。尋找CML急性變的相關基因?qū)τ诮沂綜ML發(fā)生急性變的分子機制及探索治療的新靶點具有重要的意義。有研究表明，BMI-1(B-cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site1)基因表達增高的病例更易轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙园籽1]。本文用免疫組化方法，檢測BMI1基因表達產(chǎn)物BMI-1蛋白在CML各期中的表達，初步探討B(tài)MI-1蛋白在CML中的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 CML診斷及療效判定參照張之南主編 《血液病診斷及療效標準》[2]。選擇2010年1月至2014年12月在南通大學第二附屬醫(yī)院血液科就診的門診和住院的CML患者41例，男29例，女12例，年齡42～79歲。其中慢性期(CML-CP)26例，加速期(CML-AP)6例，急變期(CM-BP)9例。加速期和急變期15例化療后完全緩解11例 (緩解組)，未緩解4例(未緩解組)。對照組10例來自本院健康志愿者，男7例，女3例，年齡48～70歲。

1.2 檢測方法 用免疫組織化學法檢測CML患者骨髓單個核細胞BMI-1蛋白，BMI-1多克隆抗體為美國Santa Crus公司的產(chǎn)品，生物素標記的羊抗小鼠二抗及SP免疫標記試劑盒為北京中杉金橋生物技術有限公司的產(chǎn)品。抽取骨髓液2ml，用EDTA抗凝，加入等量的人淋巴細胞分離液，以2 000r／min離心15min，分離出單個核細胞并涂片，干燥，室溫下用新鮮配制的丙酮溶液固定30 min，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS 0.01mol/L，pH7.4)漂洗3次；0.1%Triton 100通透10min，再用PBS漂洗3次，后根據(jù)試劑說明書進行實驗操作。每一批實驗同時做陽性及空白對照，陽性對照采用胃癌切片(由益源試劑公司提供)，以PBS代替一抗做空白對照檢測。

1.3 結果判定 細胞胞漿或細胞核上著棕黃色顆粒狀彌漫或局灶分布者為陽性細胞。參照全國免疫組化技術診斷標準化專題研討會意見，根據(jù)陽性所占的比例及顯色程度對陽性細胞進行積分：

(1)細胞質(zhì)和(或)核內(nèi)見淺黃色顆粒，明顯高于背景底色，陽性顆粒所占細胞面積的比例<50%計1分；(2)細胞質(zhì)和(或)核內(nèi)見較深黃色顆粒，陽性顆粒占細胞面積的比例約在51%~70% 計2分；(3)細胞質(zhì)和(或)核內(nèi)見大量深黃色顆粒，漿和(或)核可被顆粒掩蓋而不顯，陽性顆粒所占細胞面積的比例>70%計3分。每片計500個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算表達率及陽性積分。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料用均值±標準差(x±s)表示，多組間檢驗采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗；兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 BMI-1蛋白在各期CML患者骨髓單個核細胞中的表達 BMI-1蛋白陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀大多數(shù)定于細胞漿內(nèi)，見圖 1，CML-AP/BP組BMI-1蛋白表達陽性率及陽性積分均顯著高于對照組和CML-CP組(P<0.05)，CML-CP組和對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 CML細胞 BMI-1蛋白表達(S-P法染色，×1000)

表1 BMI-1蛋白在各組中表達的比較

2.2 BMI-1蛋白在CML-AP/BP患者治療后骨髓單個核細胞表達的比較 BMI-1蛋白陽性產(chǎn)物呈棕黃色細顆粒狀大多數(shù)彌散于細胞胞漿內(nèi)，未緩解組BMI-1的表達顯著高于緩解組(P<0.05)。見表2。

表2 BMI-1蛋白在治療一療程緩解組及未緩解組表達的比較(±s)

表2 BMI-1蛋白在治療一療程緩解組及未緩解組表達的比較(±s)

注：與未緩解組比較，*t=3.562,P=0.0003；△t=5.431,P=0.0000。

組別 例數(shù) 陽性率(%) 積分(分)未緩解組緩解組5 11 40.78±12.58 12.98±10.11*68.24±7.22 17.63±6.29△

3 討論

1991年荷蘭癌癥中心在研究小鼠淋巴瘤時發(fā)現(xiàn)了BMI1基因，后被認為是癌基因C-myc的協(xié)同基因，屬于多梳基因PcG(Polycomb group，PcG)家族；人類BMI1基因定位于10號染色體的短臂1區(qū)3帶(10p13)，該區(qū)與惡性淋巴瘤和兒童白血病的染色體移位有關，BMI1基因與干細胞成長調(diào)控，細胞分化及惡變密切相關[3-7]。此外，BMI1基因在細胞周期的調(diào)節(jié)、細胞的永生化和衰老方面也有著重要作用[8，9]。 其有類似于癌基因的作用[10，11]。 動物試驗表明[12]，表達BMI1的小鼠外周血中白血病細胞的數(shù)量明顯多于BMI1缺失的小鼠，將BMI1缺失小鼠的骨髓細胞移植給受者小鼠，這些小鼠不發(fā)生急性髓系白血病，但將BMI1轉(zhuǎn)染原本BMI1缺失的小鼠骨髓細胞中，然后移植給受者小鼠，受者小鼠則可發(fā)生急性髓系白血病，說明Bmi1對白血病干細胞的增殖以及致白血病的能力具有決定性作用。研究還發(fā)現(xiàn)[13]，急性白血病病人的骨髓中BMI1的表達水平明顯高于正常人，尤其是在急性髓細胞白血病微分化型的病人骨髓中，BMI1的表達水平更高。

本研究通過免疫組織化學法檢測CML患者骨髓單個核細胞中BMI1基因的表達，發(fā)現(xiàn)CMLAP/BP組BMI-1蛋白陽性率及積分遠高于對照組和 CML-CP組(P<0.05)，CML-CP組則和對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示BMI1基因可能在CML急變過程中發(fā)揮了一定的作用，其分子機制尚需進一步闡明。本研究發(fā)現(xiàn)標準方案化療一療程未緩解組BMI-1蛋白陽性率及積分顯著高于一療程緩解組(P<0.05)，提示BMI1基因高表達與CML細胞對化療藥物的敏感性有關，其分子機制尚需進一步闡明。結果還提示BMI1基因高表達參與了CML的急性變，干預BMI1基因的表達可能為CML靶向治療提供新的思路。檢測CML患者骨髓單個核細胞中BMI1基因的表達水平可作為預后評價的一個參考指標，對臨床治療具有一定的指導意義。

[1]Mihara K,Chowdhury M,Nakaju N,et al.Bmi-1 is useful as a novel molecular marker for predicting progression of myelodysplastic syndrome and patient prognosis[J].Blood,2006,107(1):305-308.

[2]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].第3版.北京:科學出版社,2007:134-136.

[3]Sauvageau M,Sauvageau G.Polycomb group genes:keeping stem cell activity in balance[J].PLoSBiol,2008,6(4):e113.

[4]Takihara Y.Role of Polycomb-group genes in sustaining activities of normal and malignant stem cells[J].Int JHematol,2008,87(1):25-34.

[5]Lobo NA,Shimono Y,Qian D,et al.The biology of cancer stem cells[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2007,23:675-699.

[6]Valk-Lingbeek ME,Bruggeman SW,Lohuizen M.Stem cells and cancer;the polycomb connection[J].Cell,2004,118(4):409-418.

[7]Park IK,Morrison SJ,Clarke MF.Bmi1,stem cells,and senescence regulation[J].JClin Invest,2004,113(2):175-179.

[8]Jiang Y,Su B,Meng X,et al.Effect of siRNA-mediated silencing of Bmi-1 gene expression on HeLa cells[J].Cancer Sci,2010,101(2):379-386.

[9]Silva J,Garcia JM,Pena C,et al.Implication of polycomb members Bmi-1,Mel-18,and Hpc-2 in the regulation of p16INK4a,p14ARF,h-TERT,and c-Myc expression in primary breast carcinomas[J].Clin Cancer Res,2006,12(23):6929-6936.

[10]Honig A,Weidler C,Hlttuder S,et al.Overexpression．of polyeomb protein BMI1 in human specimens of breast，ovarian，endometrial and cervical cancer[J].Anticancer Res,2010,30(5):1559-1564．

[11]吳敏華,容伯芬,陳妙嬋.慢性粒細胞白血病骨髓染色體核型異常的結果分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2011,29(1):87.

[12]Lessard J,Sauvageau G.BMI-1 determines the proliferative capacity of normal and leukaemic stem cells[J].Nature,2003,423(6937):255-260.

[13]Sawa M,Yamamoto K,Yokozawa T,et al.BMI-1 is highly expressed in M0-subtype acute myeloid leukemia[J].Int J Hematol,2005,82(1):42-47.