李觀華，潘志雄，劉曉峰，陳雪禮，薛國輝

(九江市第一人民醫(yī)院/南昌大學附屬九江醫(yī)院，檢驗科332000)

卵巢癌是常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，也是死亡率最高的癌癥之一，全球范圍內每年新發(fā)卵巢癌患者超過22萬人次[1]，而在我國每年每10萬人中就有5個被診斷為新發(fā)卵巢癌[2]。臨床上超過70%的患者就診時已是晚期，而早期卵巢癌患者5年生存率可達70%～90%，晚期卵巢癌患者5年生存率則僅為20%～30%[3]。卵巢癌早期診斷并及時治療，患者的存活率可高達90%[4]，因此早期及時準確診斷是改善預后的關鍵問題。病理組織檢測是診斷腫瘤的金標準，但因早期未能及時發(fā)現，病理檢測也較為困難，因而血清學檢測成為早期研究的重點。

目前如CA-199、CA-125、CEA等糖類抗原已用于卵巢癌臨床診斷[5]。關于其準確性和研究也有較多報道，但單獨檢測的靈敏度較低[6]，所以臨床上常使用多種腫瘤標志物聯(lián)合檢測[7]，并配合病理檢測來診斷，新型腫瘤標志物的研究成為焦點。KiSS-1基因最先是被鑒定為黑色素瘤轉移的一種抑制基因，新近研究發(fā)現KiSS-1是多種癌癥中的轉移抑制因子[8]。已有大量的證據[9,10]表明KiSS-1表達下調與較差的臨床預后密切相關，KiSS-1在腫瘤生物學中的作用可能是通過其與在多種腫瘤侵襲轉移發(fā)揮重要作用的基質金屬蛋白酶(MMP)相互作用發(fā)揮抑制作用的[11]。KiSS-1基因表達缺失同樣存在于在卵巢癌中，但其應用于臨床卵巢癌免疫學診斷則少見報道，我們前期研究通過克隆純化KiSS-1蛋白并免疫動物提純出兔抗人KiSS-1抗體[12]，并利用KiSS-1抗體和KiSS-1蛋白建立ELISA法，本研究利用前期建立的ELISA法檢測卵巢癌患者血清KiSS-1蛋白水平，并結合其他糖類抗原檢測，綜合評價KiSS-1水平診斷價值，為卵巢癌早期臨床診斷提供參考價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年1月至2014年6月在本院婦科由病理確診的80例卵巢癌和卵巢良性腫瘤患者及同期體檢中心26例健康體檢者，分為以下三組進行研究：(1)健康對照組26例：為本院體檢中心女性，各項功能均正常，無良性卵巢疾病史，年齡25～68歲，平均年齡42.2歲。(2)卵巢癌組62例：所有患者均為本院住院患者，經病理等檢查確診為卵巢癌，包括漿液性腺癌28例、黏液性腺癌19例、低分化腺癌15例。年齡在30～62歲，平均46.1歲。(3)卵巢良性腫瘤組18例：經病理確診卵巢良性腫瘤，包括子宮肌瘤8例、卵巢囊腫5例、良性畸胎瘤5例，年齡27～55歲，平均38.3歲。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 三組受檢人群均在清晨空腹時靜脈采血5ml，2h內分離血清檢測相關指標。

1.2.2 糖類抗原檢測方法 運用羅氏Combs 6000化學發(fā)光分析儀檢測血清糖類抗CA-125、CA-199、CEA水平。所有檢測均按儀器及試劑說明書規(guī)范操作。 CA-125≥35U/ml、CA-199≥37 U/ml、CEA≥15μg/L判斷為陽性，低于該界值判斷為陰性。

1.2.3 KiSS-1檢測方法 采用前期研究中得到及提純的兔抗人KiSS-1分子多克隆抗體建立KiSS-1檢測的雙抗體夾心ELISA方法，具體如下：(1)包被：用pH 9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為0.55μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。(簡稱洗滌，下同)。(2)加樣：加一定稀釋的待檢樣品100μl于上述已包被的反應孔中，置37℃孵育1h。然后洗滌。同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔。(3)加酶標抗體：于各反應孔中，加入來自華美生物有限公司購買的新鮮稀釋的辣根過氧化物酶酶標抗體(經滴定后的稀釋度 100)，37℃孵育 0.5h，洗滌。(4)加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100μl，37℃10～30min。 (5)終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸50μl。立即在自動酶標儀上讀取450nm吸光度值，空白孔凋零,反應孔內顏色越深，陽性程度越強,OD值越高，陰性反應為無色或極淺。結果判定：樣品血清每份做2孔，取平均值判斷結果，空白孔調零，選擇7個正常血清和2個卵巢癌患者血清作為判斷每批ELISA試驗之間可靠性的指標；100例正常人血清OD值的平均值加2個標準差為判斷臨界值，高于此為陽性，低于此為陰性。ELISA檢測陰性判定為KiSS-1診斷陽性(缺失為陽性)，反之則為陰性。

1.3 診斷效能評價指標 計算方法為：靈敏度=標志物真陽性數/(標志物真陽性數+標志物假陰性數)；特異性=標志物真陰性數/(標志物真陰性數+標志物假陽性數)；準確率=標志物真陽性數+標志物真陰性數/總病例數；Youden指數(靈敏度+特異性－100%)表示。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理。所有計量資料的實驗數據經正態(tài)性檢驗，數據呈非正態(tài)分布，用中位數(四分位數間距)表示，各組之間比較用Mann Whitney U檢驗(非參數檢驗)。組間計數資料率比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組人群中 KiSS-1、CA-125、CA-199、CEA 的診斷陽性率比較 經測定后對原始數據進行統(tǒng)計分析，結果見表1，可見所測4類抗原在卵巢癌組和卵巢良性腫瘤組的診斷陽性率均顯著高于對照組和卵巢良性腫瘤中有顯著差異。其中CA-125在卵巢癌和良性腫瘤組中陽性率為各檢測抗原中最高，敏感性最高。KiSS-1在血清中對卵巢癌組和卵巢良性腫瘤的診斷陽性率明顯高于對照組 (P<0.05)，但與CA-125、CA-199標志物相比診斷陽性率相對較低，其敏感性與CEA相當。KiSS-1在卵巢癌中表達陽性率在良性卵巢癌腫瘤和卵巢癌中均有所下降。此外，可以發(fā)現在3例健康對照中，KiSS也出現診斷率陽性情況，即表達缺失。

表1 KiSS-1、CA-125、CA-199、CEA在各組受檢人群中診斷陽性率結果比較

2.2 KiSS-1與 CA-125、CA-199、CEA 在卵巢癌診斷中的靈敏度、特異度、準確性及Youden指數比較在卵巢癌組患者中，CA-125的敏感性最高為79.03%，高于其他標志物，其中KiSS-1較現有腫瘤標志物靈敏度低為48.39%。四類標志物特異性水平均較高，其中KiSS-1特異性達到79.55%，略低于CA-199和CEA。準確性CA-125最高為79.25%，CEA和KiSS-1對卵巢癌的診斷準確性比較接近。Youden指數由高到低依次為CA-125(54.03%)、CA199(44.72%)、CEA(35.70%)和 KiSS-1(27.94%)，KiSS-1 Youden指數水平較低。綜合分析，CA-125和CA-199作為單個標志物在卵巢癌診斷中診斷性能較高；而KiSS-1與CEA診斷水平總體相當，或可成為診斷卵巢癌的一種新型指標。見表2。

2.3 KiSS-1聯(lián)合 CA-125、CA-199、CEA 在卵巢癌診斷中的靈敏度、特異性、準確性及Youden指數的比較 CA-125作為卵巢上皮性腺癌的首先標記物，在本研究中也體現出對卵巢癌診斷的優(yōu)勢，因此作為聯(lián)合診斷的必要標志物。KiSS-1聯(lián)合CA-125及其他標志物時，靈敏度、特異性、準確性及Youden指數均隨著指標組合增加而升高，表明聯(lián)合檢測的診斷效果更強。其中KiSS-1+CA125+CA199+CEA組合對卵巢癌診斷準確率高達91.25%。KiSS-1作為單個診斷因素時診斷效果顯然低于CA-125等，但與其他腫瘤標志物聯(lián)合檢測時大大提升了原有組合(CA125+CA199+CEA)的診斷能力。聯(lián)合檢測時統(tǒng) 計 KiSS-1、KiSS-1+CA-125、KiSS-1+CA125+CA199、KiSS-1+CA125+CA199+CEA 及 CA125+CA199+CEA幾組的實際數目來計算它們的靈敏度、特異性、準確性及Youden指數。聯(lián)合檢測時，只要任何一項是陽性即可總體判斷為陽性；所有標志全為陰性則判斷為總體陰性。見表3。

表2 KiSS-1與CA-125、CA-199、CEA在卵巢癌診斷中的靈敏度、特異性、準確性及Youden指數的比較(%)

表3 KiSS-1、CA-125、CA-199、CEA聯(lián)合檢測在卵巢癌診斷中的靈敏度、特異性、準確性及Youden指數的比較

3 討論

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內膜癌，但病死率卻超過兩者之和，具有較高的病死率，主要原因是早期臨床診斷困難及治療后腫瘤易復發(fā)。卵巢癌早期無任何癥狀，較難發(fā)現，就醫(yī)時多為中晚期，術后五年生存率低[13]。故而早期診斷對于臨床診療意義重大。

目前卵巢癌早期只能通過血清腫瘤標志物等篩查，血清腫瘤標志物在臨床腫瘤疾病的診斷、病情監(jiān)測和預后判斷等方面有著重要意義[14]。但由于腫瘤細胞生物學具有復雜和多樣性的特性，相同類型的腫瘤可產生一種或多種腫瘤標志物，而不同腫瘤或同一腫瘤的不同組織類型既可以產生相同的腫瘤標志物，也可以產生不同的腫瘤標志物，所以絕大部分單一的腫瘤標志物檢測的敏感性或特異性偏低，不能達到臨床診療的需要，尤其是卵巢癌的早期診斷，血清CA-125在卵巢癌診斷中的特異性一直較好，但由于CA-125主要表達于漿液性卵巢癌，并且其水平高低與卵巢癌的臨床分期密切相關，中、晚期卵巢癌患者血清中CA-125檢測的水平和陽性率較高，而早期患者CA-125水平和陽性率不高[15]。因此，針對不同類型的腫瘤，組合不同的標志物進行多指標聯(lián)合檢測，對腫瘤的及早治療極為重要。目前臨床對卵巢癌診斷主要聯(lián)合檢測指標有CA-125、CA-199、CEA等，但診斷準確性有待提高，亟需新型標志物參與聯(lián)合檢測以提高診斷能力。本研究選用KiSS-1作為新型指標，并聯(lián)合 CA125、CA199、CEA聯(lián)合檢測，探討單個及聯(lián)合檢測模式在卵巢癌篩查和早期診斷中的臨床價值。KiSS-1表達缺失常見于多種腫瘤中，如卵巢癌，但目前對KiSS-1作為癌癥診斷標志物的研究則鮮有報道。本研究通過研究卵巢癌患者血清KiSS-1水平，并評價其診斷性能，判定其在早期卵巢癌診斷中的價值。結果發(fā)現KiSS-1單獨檢測時特異性和靈敏度均不是很高，與CEA診斷效果相當，但當其與CA125、CA199、CEA聯(lián)合檢測時則可以顯著提高診斷準確性，這表明聯(lián)合檢測對于卵巢癌診斷優(yōu)勢明顯，這與美國學者的研究結果相符[16]。當KiSS-1加入原有檢測組合CA125+CA199+CEA時，可顯著提升診斷準確性近10%，因而KiSS-1或可成為卵巢癌診斷的新型標志物。

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