王建偉，孫嘉峰，黃毅

(1、福建省立醫(yī)院南院福建省立金山醫(yī)院檢驗科，福建 福州350008；2、福建省立醫(yī)院檢驗科，福建 福州350001)

乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus Deoxyribonucleic acid，HBV DNA)是反映HBV復制活躍程度及傳染性的最直接指標，也是觀察抗病毒藥物療效、預后和指導抗病毒藥物應用的重要指標之一。HBVDNA定量檢測從根本上突破了免疫學方法等間接方法的局限性，通過直接檢測病毒核酸水平，可真實反應患者體內(nèi)病毒水平[1-3]。目前提取HBVDNA主要采用煮沸法，該法不能有效去除干擾物質(zhì)如血紅蛋白，提取的血漿HBV DNA含量較低，接近臨界值標本的提取結(jié)果不穩(wěn)定，在臨床檢測中容易產(chǎn)生假陰性[4]。本研究應用西安天隆NP968自動核酸提取儀(磁珠法)提取HBVDNA，相比傳統(tǒng)的煮沸法，具有快速、簡便、減少人工誤差等特點。根據(jù)ISO15189醫(yī)學實驗室認可標準[5]，必須對其檢測系統(tǒng)進行性能評價，本文通過分析其精密度、線性、回收率、最低檢出限，并將檢測結(jié)果與傳統(tǒng)煮沸法進行對比，分析其相關性，從而評價該法對HBVDNA檢測的性能。

1 材料與方法

1.1 標本來源 來自2014年10月13日至10月17日我院PCR實驗室接收的79例門診患者血漿標本及我院免疫室接收的20份我院國內(nèi)體檢健康人血清標本。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試劑 HBVDNA熒光定量PCR檢測試劑盒與HBVDNA標準品(廣州達安公司)；核酸提取(磁珠法)試劑盒(西安天隆公司)。

1.2.2 儀器 NP968核酸提取儀(NP968，西安天隆公司)；ABI7300實時熒光PCR儀 (ABI7300,美國ABI公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1 HBVDNA提取與檢測

1.3.1.1 煮沸法 按照達安公司HBVDNA熒光定量PCR檢測試劑盒說明書取待測血漿樣本、HBVDNA熒光定量PCR檢測試劑盒內(nèi)陽性對照品、陰性對照品、標準品和自制高值、低值質(zhì)控品各30μl，分別加入70μl核酸提取液，充分振蕩混勻后 ，100℃ 恒 溫 處 理 10±1min，12000r/min 離 心5min，取 20μl上清液加入反應管，在 ABI7300實時熒光PCR儀上進行HBVDNA的定量檢測。

1.3.1.2 磁珠法 按照NP968自動核酸提取儀 (磁珠法)試劑盒說明書，取待測血漿、達安試劑盒陽性對照品、陰性對照品、標準品和質(zhì)控品各200μl，加入預先分裝好自動核酸提取液的板孔內(nèi)，放入NP968自動核酸提取儀內(nèi)，按預定的提取程序自動執(zhí)行核酸提取，最終得到100μl洗脫液，取20μl上清液加入反應管，在ABI7300實時熒光PCR儀上進行HBVDNA的定量檢測。

1.3.2 精密度評價 按照CLSI EP15-A2標準：2個濃度水平，5d實驗，每天一批，每批每個水平重復測定3次，所有測定數(shù)據(jù)均轉(zhuǎn)化為對數(shù)值。

1.3.3 線性評價 選擇1份高值患者血漿標本，濃度接近廠家試劑盒說明書給出的線性范圍上限(5.00E8 IU/ml)，按1:10用正常人血漿倍比稀釋此高值標本直至濃度接近線性范圍下限 (1.00E2 IU/ml)，形成濃度由高到低7份待測實驗樣品。每份實驗樣品在檢測系統(tǒng)上重復測定2次,結(jié)果轉(zhuǎn)換為對數(shù)，取2次測定的均值作為實測值(Y)；以其系列稀釋后理論上應含有的濃度(亦取對數(shù))作為預期值(X)，將所有結(jié)果點在X-Y坐標圖上，計算回歸方程:Y=bX+a。

1.3.4 回收率 選擇廠家配套低值標準品為基礎樣本，取180μl基礎樣本和20μl蒸餾水作為對照樣本， 分別取 180μl基礎樣本和 20μl濃度為2.0E6IU/ml、2.0E5IU/ml和 2.0E4IU/ml的標準品作為回收樣品。每份樣品在檢測系統(tǒng)上測定3次，結(jié)果轉(zhuǎn)換為對數(shù)，取平均值。根據(jù)以下公式計算回收率：回收率=回收濃度/加入濃度×100%；回收濃度=最終測定濃度-基礎樣本濃度；加入濃度=標準品濃度×標準品體積/(標準品體積+基礎樣本體積)[6]。

1.3.5 最低檢出限 依據(jù)YY/T 1182-2010中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準 《核酸擴增檢測用試劑(盒)》之6.8.2條款要求[7]，采用無菌注射用水將購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心的HBVDNA血清標準物質(zhì)(1.20±0.24)E6 IU/ml按 1：10000 進行稀釋，使其濃度達到廣州達安公司HBVDNA試劑聲明的最低檢出限(1.00E2 IU/ml)后，進行25次重復檢測，以至少22次結(jié)果≥1.00E2 IU/ml為最低檢出限驗證通過；如不符合此要求，應查找原因，并補充數(shù)據(jù)或重新實驗。

1.3.6 參考區(qū)間 參考NCCLSC28-A2，通過測定29份我院國內(nèi)體檢健康人血清標本 (標本從我科免疫組獲得，乙肝兩對半模式為全陰/或-+---/或-+--+)的 HBV DNA 濃度，對〈1.00E3 IU/ml的生物參考區(qū)間進行驗證；若20份標本的檢測結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)或僅有2個標本超出，則驗證通過。否則，進行參考區(qū)間確立實驗。

1.3.7 相關性評價 分別采用煮沸法和磁珠法提取79例患者血漿標本進行熒光定量PCR，比較兩種方法的相關性。

1.4 統(tǒng)計學方法 將定量HBVDNA拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為對數(shù)值，所有統(tǒng)計學處理均在SPSS20.0統(tǒng)計軟件包上進行。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗證 低、高水平樣本檢測的批內(nèi)精密度均<3/5TEa，批間精密度均<4/5TEa。該檢測方法的批內(nèi)及批間精密度均符合廠家要求小于5%(見表1)。

表1 精密度驗證結(jié)果

2.2 線性范圍驗證 HBV-DNA在4.16E2-4.16E8 IU/ml范圍內(nèi)具良好線性關系 (廠家線性范圍1.0E2-5.0E8 IU/ml)，R2=0.989，b=1.01 在 0.97~1.03范圍內(nèi)；a=0.271，經(jīng)t檢驗顯示a與0無顯著性差異(P>0.05)(見表 2，如圖 1)。

表2 線性范圍驗證結(jié)果

圖1線性驗證數(shù)據(jù)散點圖

2.3 回收實驗 根據(jù)相關公式計算的檢測平均回收率為104%。見表3。

2.4 最低檢出限驗證 廠家聲明的最低檢出限(1.00E2 IU/ml)驗證試驗通過。見表4。

2.5 參考區(qū)間 參考區(qū)間為<1.00E3 IU/ml。見表5。2.6兩種方法檢測結(jié)果的相關性分析 以煮沸法檢測結(jié)果為X，以磁珠法檢測結(jié)果為Y，經(jīng)分析顯示兩者相關性良好(Y=0.995X+0.526,R2=0.951。見圖2。

表3 回收實驗結(jié)果

表4 最低檢出限驗證實驗結(jié)果

表5 參考區(qū)間驗證結(jié)果

圖2磁珠法與煮沸法檢測結(jié)果相關性分析

3 討論

我國人群對HBV普遍易感，HBVDNA是HBV感染最直接、特異性強和靈敏性高的指標。HBVDNA陽性提示HBV復制和有傳染性，其含量越高表示病毒復制越厲害，傳染性越強。因此，HBV DNA定量檢測對于判斷乙型肝炎傳染性強弱、乙型肝炎病毒復制情況、乙型肝炎抗病毒治療效果等都有十分重要的意義[8-11]。

病毒核酸的檢測是生命科學領域一個重要的分支，在臨床病原體檢測、傳染性疾病及基因診斷方面具有獨特的應用價值。核酸提取是核酸檢測中關鍵的步驟，直接影響后續(xù)實驗結(jié)果[12]。目前，實驗室一般采用傳統(tǒng)的手工提取方法(煮沸法、柱提取法等)。煮沸法直接將病毒DNA從病毒顆粒中釋放出來，離心后的上清液中不僅含有病毒核酸，還含有少量血紅蛋白等一些干擾PCR的抑制性雜質(zhì)；并且在處理臨床標本時，存在生物安全等問題。因此，臨床實驗室迫切需要自動化方法來進行核酸提取[13]。隨著納米技術的發(fā)展，極大的推動了基于磁珠微球的自動核酸提取法的發(fā)展，目前自動核酸提取法(磁珠法)已經(jīng)應用于臨床核酸(DNA和RNA)等多種物質(zhì)的分離和純化[14]。磁珠法方法提取的核酸純度高，能夠除去大多干擾PCR的抑制因子，如蛋白質(zhì)、多糖、酚類等物質(zhì)，使實時熒光定量PCR檢測方法更靈敏、更準確[15]。NP968自動核酸提取儀具有自身的優(yōu)勢：(1)提取速度快，操作時間短，30~60min/次，通量大，每次可同時提取32份樣品；(2)內(nèi)置紫外光殺菌功能可自我清潔；(3)嚴格控制孔間污染及批次間污染；(4)能有效避免人工操作引起的差異及錯誤，結(jié)果穩(wěn)定，重復性好。

精密度評價實驗按照EP15-A2文件進行，實驗數(shù)據(jù)顯示基于NP968自動核酸提取儀 (磁珠法)的實時熒光定量PCR系統(tǒng)，檢測HBVDNA的低、高水平批內(nèi)精密度均<3/5TEa，批間精密度均<4/5TEa，精密度良好。線性評價實驗根據(jù)CLSI EP6-A文件，采用簡便的平均斜率法，結(jié)果顯示基于NP968自動核酸提取儀(磁珠法)的實時熒光定量PCR系統(tǒng)檢測HBVDNA，在4.16E2~4.16E8 IU/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關系，達到廠家的檢測聲明。最低檢出限驗證 依據(jù)YY/T 1182-2010中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準 《核酸擴增檢測用試劑(盒)》之6.8.2條款要求，廠家聲明的最低檢出限(1.00E2 IU/ml)驗證試驗通過。在定量分析驗證時，準確度通常可用回收率表示，回收率越接近100%表明分析方法準確度越高。本研究回收實驗結(jié)果顯示，基于磁珠法的HBVDNA檢測回收率為104%，接近100%，準確度高。根據(jù)NCCLSC28-A2，參考區(qū)間<1.00E3IU/ml驗證試驗通過。此外，通過對79例患者血漿標本磁珠法與煮沸法HBVDNA檢測結(jié)果的比較，表明兩者相關性良好(Y=0.995X+0.526,R2=0.951)。總之，基于NP968自動核酸提取儀(磁珠法)的實時熒光定量PCR系統(tǒng)，實現(xiàn)了快速、自動化提取HBVDNA，對HBVDNA具有良好檢測性能，適合臨床實驗室推廣使用。

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