簡(jiǎn)正偉 ，石淙 ，聞芳 ，萬(wàn)臘根 ，張長(zhǎng)林

(1、南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330003；2、南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌330006)

急性髓細(xì)胞白血病 (acute myeloid leukemia,AML)是多能干細(xì)胞發(fā)生突變所形成的一類具有細(xì)胞和分子遺傳學(xué)特征的高度異質(zhì)性疾病。隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷的應(yīng)用于臨床，越來(lái)越多的基因突變檢測(cè)對(duì)臨床的治療起著重要提示作用。其中NPM1和FLT3-ITD基因是突變率最多見的兩類，2010年美國(guó)血液學(xué)會(huì) (American Society of hematology)會(huì)議已明確[1]，NPM1基因突變是AML,尤其是正常核型AML預(yù)后良好的指標(biāo),而具有FLT3-ITD基因突變患者預(yù)后較差。本研究分析187例初發(fā)急性髓細(xì)胞白血病患者NPM1和FLT3-ITD基因突變情況，并分析其臨床特征。

1 材料與方法

1.1 臨床病例 收集2011年6月至2013年2月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院急性髓細(xì)胞白血病初發(fā)病例187例，所有患者都經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)免疫學(xué)分型，并參照《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[2]確診為AML的病例。其中M1占9例，M2占72例，M3占50例，M4占20例，M5占24例，M6占4例。男女比例100:87，中位年齡41(13～79)歲。

1.2 染色體分析 取肝素抗凝的骨髓液2ml，換算成有核細(xì)胞約(1～2)×106／ml，然后分別用直接法和短期培養(yǎng)法制備染色體，采用G顯帶技術(shù)進(jìn)行核型分析。染色體核型描述參照《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制(ISCN 2005)》。

1.3 NPM1和FLT3-ITD突變檢測(cè) 取200μlEDTA抗凝骨髓，參照飛捷生物科技公司的微量基因組DNA極速抽提試劑盒提取基因組DNA，獲得的基因組DNA通過(guò)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，取50～100ng/μl基因組DNA進(jìn)行基因突變檢測(cè)。NPM1突變檢測(cè)方法見參考文獻(xiàn)[3]。以特異性引物擴(kuò)展FLT3-ITD基因突變區(qū),上游引物為5’gcaatttaggtatgaaagccagc-3’， 下游引物為 5’ctttcagattttgacggcaacc-3’,擴(kuò)展產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，野生型FLT3擴(kuò)展產(chǎn)物為329bp，存在ITD突變會(huì)在野生型條帶上游出現(xiàn)特異性條帶。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，以中位數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NPM1和FLT-ITD突變檢測(cè) 采用等位基因特異性PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)方法檢測(cè)NPM1基因突變，該方法可以檢測(cè)到4種常見的NPM1基因突變(圖1)。采用PCR擴(kuò)展FLT3基因第12外顯子，通過(guò)觀察PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳的遷移情況判斷FLT3-ITD突變(圖2)。在收集到的187初發(fā)急性髓系白血病患者中，共檢查到67例(35.83%)患者存在基因突變，其中39例(20.68%)AML患者存在單一 NPM1突變，15例(8.02%)出現(xiàn)單一FLT3-ITD突變，13例(6.95%)患者同時(shí)存在NPM1和FLT3-ITD突變。

圖1白血病病人NPM1突變檢測(cè)

圖2 FLT3-ITD突變檢測(cè)

2.2 NPM1和FLT-ITD突變與FAB分型關(guān)系 見表1。

表1 白血病病人基因突變情況n(%)

2.3 臨床資料特征 在187例患者中，有NPM1突變患者和非NPM1突變患者之間在男女比例、中位年齡、血小板中位數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例中位數(shù)均沒有差異性，但是白細(xì)胞中位數(shù)二者有差異(表2)。在FLT3-ITD突變患者臨床特征分析中，在男女比例、中位年齡、血小板中位數(shù)和非FLT3-ITD突變患者沒有差異性，兩者在白細(xì)胞中位數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例中位數(shù)有差異性，F(xiàn)LT3-ITD突變患者白細(xì)胞中位數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例中位數(shù)都比非FLT3-ITD突變患者高(表3)。

表2 NPM1突變患者臨床特征分析

表3 FLT3-ITD突變患者臨床特征分析

2.4 突變和細(xì)胞遺傳學(xué)的關(guān)系 在187例白血病患者中，有72例患者沒有檢測(cè)染色體或者檢測(cè)了未檢見分裂相，在可分析的115例患者中，80例正常核型當(dāng)中，有17例(21.3%)NPM1突變;在35例異常核型組中，檢見13例NPM1突變；在正常核型中同時(shí)檢測(cè)出11例FLT3-ITD突變，突變率為13.8%，而在異常核型組中，檢出8例FLT3-ITD突變，突變率為22.9%，但兩者之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表 4)。

表4 比較白血病病人NPM1和FLT3-ITD突變患者染色體情況

2.5突變型和野生型療效的比較 187例患者治療效果比較，其中NPM1突變型52例，野生型135例，2組之間≤2個(gè)治療周期CR緩解率分別為79.5%和35.8%(P<0.05);FLT3-ITD突變患者28例，野生型159例，兩者之間≤2個(gè)治療周期CR緩解率分別為27.6%和72.8%(P<0.05);隨訪時(shí)間1~25.6月，中位隨訪周期9.6月。

此外，我們把187例患者分成NPM1+/FLT3-ITD-組、NPM1-/FLT3-ITD-組、NPM1+/FLT3-ITD+組和NPM1-/FLT3-ITD+組進(jìn)行療效觀察，2個(gè)治療周期CR緩解率分別為82.3%、65.8%、52.9%和26.8%。其中單獨(dú)NPM1突變組完全緩解率最高，而單獨(dú)FLT3-ITD突變組完全緩解率最低。

3 討論

急性髓系白血病AML是起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，具有高度的異質(zhì)性。一直以來(lái)，我們都是通過(guò)檢測(cè)白血病患者染色體的變異來(lái)區(qū)分病人的預(yù)后情況。但是對(duì)于一些染色體正常核型病人，我們不能很好地區(qū)分患者的預(yù)后情況。隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷地應(yīng)用于臨床，一些新型基因突變檢測(cè)可以很好地對(duì)病人治療、預(yù)后提供指導(dǎo)價(jià)值。在這些基因突變中，NPM1和FLT3-ITD是突變率最高，對(duì)預(yù)后評(píng)估最有價(jià)值的兩類基因。

我們?cè)?87例初發(fā)白血病患者中分別檢測(cè)出NPM1突變率為27.80%(52/187)；檢測(cè)出FLT3-ITD突變率為14.97%(28/187)。 和日本學(xué)者Suzuki T(24.9%NPM1,22.6%FLT3-ITD)[4]；德國(guó)學(xué)者 Thiede C(27.5%NPM1,21%FLT3-ITD)[5]、泰國(guó)學(xué)者 Boonthimat C (26%NPM1,33%FLT3-ITD)[6]相比較，NPM1突變率基本接近，但是他們FLT3-ITD突變率都比我們的研究結(jié)果要高，可能是由于樣本分布不同和種族差異有關(guān)。

在本研究中NPM1突變主要存在于M5、M2和M1中。丁子軒等[7]研究656例中國(guó)急性髓系白血病患者NPM1基因突變情況，其中有169例突變，突變率大約25.8%，其中以M5、M1多見。Jeon Y等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在83例AML患者中有NPM1突變19例，突變率為22.9%，在形態(tài)學(xué)亞型中多見于M5和M2。這和我們的研究結(jié)果相近。但是我們研究FLT3-ITD突變多存在于M1、M4中較多見，而國(guó)外學(xué)者研究病例中FLT3-ITD突變多存在于M3[9]，這可能是病例樣本組成不同或者國(guó)內(nèi)外樣本差異有關(guān)。

我們研究FLT3-ITD突變患者在年齡 、性別和血小板中位數(shù)之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是突變陽(yáng)性患者比陰性患者在白細(xì)胞中位數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例中位數(shù)均顯著偏高，這和國(guó)外研究結(jié)果相一致[10]。這可能與FLT3-ITD突變引起近膜區(qū)空間構(gòu)型改變引起RTK持續(xù)激活,導(dǎo)致細(xì)胞增殖有關(guān)[11]。而NPM1突變患者在年齡 、性別、血小板中位數(shù)和骨髓原始細(xì)胞比例中位數(shù)同陰性患者之間無(wú)顯劇差異，但是突變陽(yáng)性患者白細(xì)胞中位數(shù)較陰性患者偏高[12]。

國(guó)內(nèi)外研究認(rèn)為NPM1和FLT3-ITD突變?cè)谌旧w正常核型多見[13]，但我們?cè)?87病例中只有115例可分析染色體核型，兩者突變?cè)谡：诵秃彤惓：诵椭g并沒有差異性，這與國(guó)外研究結(jié)果不一致，可能是國(guó)內(nèi)外病例組成不同；另外我們有72例患者沒有檢測(cè)出染色體，可能這部分病例有較多正常核型樣本，所以對(duì)正異常核型比有一定影響。

一般研究認(rèn)為NPM1基因突變是預(yù)后良好的指標(biāo)，存在NPM1基因突變的患者緩解率高，生存期長(zhǎng)，并且在疾病進(jìn)展中比較穩(wěn)定[14，15]。而FLT3-ITD突變意義則相反，一般預(yù)后較差。2008年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)和歐洲造血與血液病理學(xué)協(xié)會(huì)共同制定AML新的分型分類計(jì)劃，認(rèn)為NPM1基因突變的可以作為AML亞群中獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)[16]。我們把NPM1和FLT3-ITD突變陽(yáng)性和陰性患者在2個(gè)治療周期CR緩解率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)NPM1陽(yáng)性患者在2個(gè)治療周期CR緩解率較陰性患者效果好，而FLT3-ITD突變陽(yáng)性患者則CR緩解率效果差，兩者之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)我們按NPM1和FLT3-ITD突變陰陽(yáng)性分成四組，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)NPM1突變組完全緩解率最高，而單獨(dú)FLT3-ITD突變組完全緩解率最低，這與國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果相符[17]。

通過(guò)同時(shí)檢測(cè)NPM1和FLT3-ITD突變情況，可以給臨床白血病患者治療、預(yù)后提供指導(dǎo)意義。

[1]Foran JM.New prognostic markers in acute myeloid leukemia perspective from the clinic[J].Hematology Am Soc Hemato Educ Program,2010:47-55.

[2]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第3版．北京:科學(xué)出版社,2007:106-116.

[3]簡(jiǎn)正偉,徐芬,石淙,等.一種檢測(cè)多種NPM1突變體的ARMS-PCR方法的建立[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué),2013,21(4):1058-1062.

[4]Suzuki T,Kiyoi H,Ozeki K,et al.Clinical characteristics and prognostic implications of NPM1 mutations in acute myeloid leukemia[J].Blood,2005,106,(8):2854-2861.

[5]Thiede C,Koch S,Creutzig E,et al.Prevalence and prognostic impact of NPM1 mutations in 1485 adult patients with acute myeloid leukemia(AML)[J].Blood,2006,107(10):4011-4020.

[6]Boonthimat C,Thongnoppakhun W,Auewarakul CU.Nucleophosmin mutation in Southeast Asian acute myeloid leukemia:eight novel variants,FLT3 coexistence and prognostic impact of NPM1/FLT3 mutations[J].Haematologica,2008，93(10)：1565-1569.

[7]Ding ZX,Shen HJ,Miao JC,et al.C-kit,NPM1 and FLT3 gene mutation patterns and their prognostic significance in 656 Chinese patients with acute myeloid leukemia[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi,2012,33(10):829-834.

[8]Jeon Y,Seo SW,Park S,et al.Identification of two novel NPM1 mutations in patients with acute myeloid leukemia[J].Ann Lab Med,2013,33(1):60-64.

[9]Small D.FLT3 mutations:biology and treatment[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2006:178-184.

[10]Frohling S,Schlenk RF,Breitruck J,et al.Prognostic significance of activating FLT3 mutations in younger adults(16 to 60 years)with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics:a study of the AML Study Group Ulm[J].Blood,2002,100(13):4372-4380.

[11]Stirewalt DL,Radich JP.The role of FLT3 in haematopoietic malignancies[J].Nat Rev Cancer,2003,3(9):650-665.

[12]Dohner K,Schlenk RF,Habdank M,et al.Mutant nucleophosmin(NPM1)predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics:interaction with other gene mutations[J].Blood,2005,106(12):3740-3746.

[13]Falini B,Mecucci C,Tiacci E,et al.Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype[J].N Engl JMed,2005,352(3):254-266.

[14]Kronke J,Schlenk RF,Jensen KO,et al.Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia:a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group[J].JClin Oncol,2011,29(19):2709-2716.

[15]Schnittger S,Kern W,Tschulik C,et al.Minimal residual disease levels assessed by NPM1 mutation–specific RQ-PCR provide important prognostic information in AML[J].Blood,2009,114(11):2220-2231.

[16]Vardiman JW,Thiele J,Arber DA,et al.The 2008 revision of the World Health Organization(WHO)classification of myeloid neoplasms and acute leukemia:rationale and important changes[J].Blood,2009,114(5):937-951.

[17]Schneider F，Hoster E,Unterhalt M,et al.NPM1 but not FLT3-ITD mutations predict early blast cell clearance and CR rate in patients with normal karyotype AML(NK-AML)or high-risk myelodysplastic syndrome(MDS)[J].Blood,2009,113(21):5250－5253.